1. Минору Toyota , 

2. Coty Хо , 

3. Нита Ahuja , 

4. Кам-Wing Иаира , 

5. Цин Ли ,

6. Mutsumi Ohe-Toyota ,

7. Стивен Б. Бейлин , и 

8. Жан-Пьер Исса J. 2

+Принадлежность Автор

1. Джона Хопкинса онкологического диспансера, Baltimore, Maryland 21231

 

Следующий раздел

Абстрактный

Метилирования CpG острова был связан с инактивации опухолевых супрессоров гена при новообразованиях и может служить полезным показателем для клонирования романа, связанных с раком генов. Мы разработали новый ПЦР-методом, метилированный CpG усиление острова (MCA), который является полезным для анализа метилирования и клонирование дифференциально метилированные гены. Использование ферментов рестрикции, которые имеют различную чувствительность к 5-метил-цитозина, с последующим лигированием адаптера и ПЦР-амплификации, метилированный CpG богатых последовательностей может быть преимущественно усиливается. В модельном эксперименте с использованием зонда от экзона 1 p16 ген, был обнаружен сигнал от продуктов МСА из толстой линии раковых клеток, но не в нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Идентификация новых CpG островов дифференциально метилировано в колоректальный рак, мы применили MCA в сочетании с представительской анализа разницы в клетку рака толстой кишки линии Сасо2 в качестве тестера и нормальной слизистой оболочки толстой кишки в качестве водителя. Используя эту стратегию, мы выделили 33 дифференциально метилировано последовательностей ДНК, в том числе фрагменты идентичны несколько известных генов ( PAX6 , Versican , α-тубулина , CSX , OPT и рРНК). Ассоциации гиперметилирование полученных клонов и транскрипционной подавление при колоректальном раке была подтверждена путем анализа Versican гена, который мы обнаружили, молчать в метилированный клеточных линий и реактивировать метилирование ингибитор 5-аза-2'-дезоксицитидином. Поэтому мы предлагаем MCA является полезным методом для изучения метилирования и изолировать CpG островов дифференциально метилировано в рак.

Предыдущий разделСледующий раздел

Введение

В развитии рака, ряд генов-супрессоров опухолей инактивируют мутации и хромосомные делеции (1) . Аберрантное метилирование CpG островов Недавно было показано, чтобы служить в качестве альтернативного способа инактивации таких генов в рак. CpG острова короткие последовательности богатые CpG динуклеотиде и могут быть найдены в регионе 5 "около половины всех генов человека (2) .Метилирование цитозина в течение 5 'CpG островков, связанные с потерей экспрессии генов и была замечена в физиологических условиях, таких как Х-хромосомы инактивации (3) и геномного импринтинга (4) . Аберрантное метилирование также происходит при старении (5) и канцерогенеза и связан с транскрипционного молчания нескольких генов, в том числе известный семейной генов рака (6 , 7) . Это привело к предположению, что новые гены-супрессоры опухолей могут быть выделены с помощью аберрантно метилировано CpG островов в качестве маркера (8) . В последние несколько лет некоторые методы были разработаны для обнаружения нарушения метилирования рак (9 , 10 , 11 , 12) . Хотя эти методы являются очень мощными в обнаружении различий метилирования, они ограничены известными генами, поскольку они требуют информации о последовательности для проектирования праймеров ПЦР. Совсем недавно другие методы, такие как ограничение ориентир сканирования геномных и произвольно грунтовка-PCR были использованы для выделения новых метилированных последовательностей (13 , 14 , 15 , 16) . Тем не менее, количество CpG острова клонированные таким образом остается относительно ограниченным. Для выделения дифференциально метилированные CpG островов в раку и нормальных тканей, мы разработали новую технологию, называемую MCA. 3 MCA позволяет эффективно ПЦР-амплификации метилированном CpG островов, которая может обнаружить метилирование многих генов, или клонировать CpG островов в дифференциально метилировано рака. Применяя MCA в сочетании с RDA к опухоли толстой кишки, мы выделили 33 последовательностей гиперметилированы колоректального рака, в том числе несколько известных генов и CpG островов, которые сопоставляются с областью потеря гетерозиготности в злокачественных новообразований.

Предыдущий разделСледующий раздел

Материалы и методы

Образцы и клеточных линий.

Образцы тканей, рак толстой кишки и нормальной слизистой толстой кишки были получены из больницы Джона Хопкинса. Все пациенты дали информированное согласие до сбора образцов в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Все клеточные линии рака были получены из Американской коллекции типовых культур тканей. Геномную ДНК и РНК экстрагировали с использованием стандартных процедур.

MCA.

Процедура описана на рис. 1 ⇓ . Пять мкг ДНК переваривали 100 единиц Sma I в течение 6 часов (все рестрикционные ферменты были из New England Biolabs). Затем ДНК расщепляли с помощью 20 единиц Xma I в течение 16 часов. Фрагменты ДНК осаждают этанолом. RXMA и RMCA ПЦР адаптеры готовили путем инкубации олигонуклеотиды RXMA24 (5'-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAC-3 ') и RXMA12 (5'-CCGGGTCGGTGA-3') или RMCA24 (5'-CCACCGCCATCCGAGCCTTTCTGC-3 ') и RMCA12 (5'- CCGGGCAGAAAG-3 ') при 65 ° С в течение 2 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры. ДНК (0,5 мкг) лигировали с 0,5 нмоль RXMA или RMCA адаптер использованием ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs).ПЦР проводили с использованием 3 мкл каждого из лигирования смеси в качестве матрицы в 100-мкл объеме, содержащем 100 пмоль RXMA24 или RMCA24 праймера, 5 единиц ДНК-полимеразы Taq (Life Technologies, Inc), 4 м М MgCl 2 , 16 м М из NH 4(SO 4 ) 2 , 10 мкг / мл BSA и 5% объем / объем ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при 72 ° С на 5 мин и при 95 ° С в течение 3 мин. Затем образцы подвергали 25 циклам амплификации, состоящую из 1 минуты при 95 ° С, 3 мин или при 72 ° С или 77 ° С в термоциклере (Hybaid, Inc.) В последний раз был расширением 10 мин.

Просмотр увеличенной версии:

• В этой страницы

 

• В новом окне

• Скачать как слайдов PowerPoint

Рис. 1.

MCA. , схема СМА.Гипотетический фрагмент геномной ДНК представленсплошной линией , при этом семь Sma I сайты изображеноделений . м , метилированныйSma I сайтами. Фрагменты B и Dявляются CpG островов. Bметилируется как в нормальных ( правый ) и рак ( левого ), в то время как D дифференциально метилировано в рак. Для MCA, неметилированная Sma Я сайтах устраняются путем переваривания Sma I (который является метилирование чувствительны и не режет, когда его признание последовательности CCCGGG содержит метилированные CpG), что оставляет фрагмента тупыми концами. Метилированные Sma Я сайтах затем переваривают nonmethylation чувствительных Sma я изошизомером Xma I, который перерабатывает метилировано CCCGGG сайтов, оставляя КСДУ свес (липкие концы). Адаптеры лигируют к этим липкие концы, и ПЦР для амплификации метилированной последовательностей. MCA ампликонов может быть использован непосредственно в дот-блот-анализ для изучения метилирования любого гена, для которых зонд доступен ( слева ). Кроме того, MCA продукты могут быть использованы для клонирования дифференциально метилированных последовательностей RDA ( правый ). B , полуколичественного обнаружения p16 метилирование MCA. ДНК из клеточной линии Сасо2 и нормальной толстой кишки были смешаны в различных пропорциях до MCA и p16 метилирование анализировали с помощью дот-блот анализа. Процент относится к относительной доли Сасо2 ДНК. 0,1 мкг продуктов МСА были нанесены на нейлоновую мембрану и зондировали с меченым p16 экзона 1, зонда. Каждый образец уничтожены в двух экземплярах. С , примеры дот-блот анализа использованием клонов, полученных из MCA / RDA. В первых двух клонов гибридизовали с обеих Сасо2 и нормальной толстой кишки MCA продуктов и, следовательно, не дифференциально метилированные. Все остальные скрещиваться только Сасо2 и дифференциально метилировано. Lane нет , ДНК из нормальной толстой кишки 18-летнего человека. D , Саузерн-блот анализ колоректального рака и аденомы MINT3 использованием в качестве зонда. Показаны девять пар опухолей толстой кишки ( T ) и прилегающей нормальной слизистой оболочки ( N ).Сборники проводились с Eag I (метилирование регистр) и Хин DIII (фланг).Левая , размеров ДНК. 4 КБ представляет метилирования MINT3 Eag я сайт и находится в шести из девяти опухолей.

Обнаружение нарушения метилирования Использование MCA.

MCA изделий из нормальной слизистой оболочки толстой кишки и рак соответствующих тканей были получены, как описано выше. Один мкг продуктов МСА ресуспендировали в 4 мкл ТЕ [10 м М Трис (рН 8,0), 1 м М ЭДТА (рН 8,0)], смешивали с 2 мкл 20 × SSC, и 1 мкл аликвоты этой смеси уничтожены на нейлоновые мембраны (Nunc) с использованием 96-луночных системы репликации (Nunc). Мембраны выпекали при 80 ° С и УФ-сшитые в течение 2 мин. Каждый образец уничтожены в двух экземплярах. Каждый фильтр включен смесей положительного контроля (Сасо2) и отрицательный контроль (нормальной слизистой оболочки толстой кишки от 18-летнего индивидуального), как показано на рис. 1 B ⇓. Гибридизационных зондов ( p16 экзона 1, Ref. 17 ) или MINT клонов метили 32 P с помощью случайного праймера и Фильтры гибридизовали в течение 12-16 ч, промывали воздействию люминесцентным экраном в течение 24-72 ч, а разработаны использованием PhosphorImager (Molecular Dynamics). Интенсивность каждого сигнала рассчитывали с помощью программного обеспечения изображения Quant и метилирование уровни были определены по сравнению с контрольными образцами.

RDA.

RDA проводили, по существу, как сообщалось ранее (18) со следующими модификациями. Для первого и второго раунда конкурентной гибридизации, 500 и 100 нг лигирования смеси были использованы, соответственно. Для устранения переваривается адаптер, кДНК выделяемых колонка (Amersham) использовали вместо вырезания из агарозного геля. Праймеры, используемые для первого и второго раунда RDA были следующими: JXMA24 (5'-ACCGACGTCGACTATCCATGAACC-3 '), JXMA12 (5'-CCGGGGTTCATG-3'), JMCA24 (5'-GTGAGGGTCGGATCTGGCTGGCTC-3 '), JMCA12 (5 '-CCGGGAGCCAGC-3'), NXMA24 (5'-AGGCAACTGTGCTATCCGAGTGAC-3 '), NXMA12 (5'-CCGGGTCACTCG-3'), NMCA24 (5'-GTTAGCGGACACAGGGCGGGTCAC-3 '), и NMCA12 (5'-CCGGGTGACCCG-3 »).После второго раунда конкурентной гибридизации, ПЦР-продукты перевариваютXma I. Адаптер J был ликвидирован фильтрационной колонки. ПЦР-продукты затем субклонируют в pBluescript SK (-) (Stratagene). На экран для вставки, в общей сложности 396 клоны культивировали в течение ночи в LB-среды с ампициллином и 3 мкл культурального непосредственно использовали в качестве матрицы для ПЦР.Каждый клон амплифицировали с Т3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ') и Т7 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3') праймеры, блоттинга на нейлоновую мембрану и подвергали скринингу на перекрестную гибридизацию с 32 P меченых вставок.Клоны дифференциально гибридизации с тестером и водитель MCA продукты были дополнительно характеризовали при помощи Саузерн-блот-анализа и секвенирования ДНК. Все последовательности были депонированы в GenBank.

Саузерн-блоттинга.

Пять мкг ДНК переваривали 20-100 единиц рестрикционных ферментов, как указано изготовителем (New England Biolabs). Фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (Зета-зонд; Bio-Rad).Фильтры гибридизовали с 32 P-меченых зондов и промывают при 65 ° C с 2 × SSC, 0,1% SDS в течение 10 мин дважды и 0,1 × SSC, 0,1% SDS в течение 20 мин. Затем фильтры экспонировали с пленкой фосфора в течение 24-72 ч и анализировали с использованием PhosphorImager (Molecular Dynamics).

ДНК-секвенирования и анализа.

Плазмидную ДНК получали с использованием Wizard Plus Minipreps (Promega) в соответствии с рекомендациями поставщика. Анализ последовательностей проводили при Johns Hopkins фонда основной последовательности с использованием автоматизированных секвенсорами ДНК (Applied Biosystems).Гомологии последовательностей были определены с использованием программы BLAST Национального центра биотехнологической информации доступна на http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Предполагаемые последовательности промоутера были предсказаны с использованием компьютерных программ и Нововоронежской АЭС TSSG доступны через колледжа Бэйлора запуска, на http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331.

Хромосомные Mapping.

Хромосоме клонов, которые не соответствуют известных генов определяли с помощью человека-грызун соматических клеток гибридный панель и панель излучение гибридных (Research Genetics). ПЦР проводили с использованием 30 нг каждого из гибридной ДНК панели в качестве матрицы в 40 мкл, содержащей 15 пмоль каждого праймера, 0,5 единицы ДНК-полимеразы Taq (Life Technologies, Inc), 2 м М MgCl 2 , BSA и 5% ДМСО. Первая денатурации проводили при 95 ° С в течение 3 мин. Образцы подвергали 35 циклам амплификации, состоящий из 25 сек при 94 ° С, 1 мин при 60-68 ° С, 1,5 мин при 72 ° С в термоциклере (Hybaid). В последний раз был расширением 10 мин. Десять мкл ПЦР-продукт подвергали электрофорезу в 2% агарозном, а генотип каждой панели был определен. Связь анализ проводился с использованием сервера RH из Стэнфордского университета (http://www-shgc.stanford.edu/RH/index.html). Последовательности праймеров ПЦР используется для усиления каждого клона предоставляются по запросу.

ОТ-ПЦР.

Для анализа ОТ-ПЦР, восемь колоректального рака клеточных линий (Сасо2, РКО, SW48, Лово, НСТ116, DLD-1, НТ-29 и SW837) и два гемопоэтических клеточных линий рака (CEM и Raji), были использованы. Общую РНК получают из нормального эпителия толстой кишки и линий опухолевых клеток с использованием тризола (Life Technologies, Inc.) Изучение экспрессии гена после деметилирования, клеточные линии смешивают с 1 μ М из 5-аза-2'-дезоксицитидин в течение 2-5 дней. кДНК получали с использованием случайных гексамеров и обратной транскриптазы, как указано изготовителем (Life Technologies, Inc.) Выражение Versican было определено с помощью ОТ-ПЦР с применением праймеров 5'-VF GCTGCCTATGAAGATGGATTTGAGC-3 'и 5'-VR GGAGTTCCCCCACTGT-TGCCA-3'.ПЦР-продукты визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. КДНК образцы также амплифицировали с использованием GAPDH ген ГАПФ праймеров 5'-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3 'и 5'-GAPR AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' в качестве контроля целостности РНК. Все реакции проводили с использованием обратной транскриптазы (-) контролирует где фермента обратной транскриптазы был опущен.

Бисульфит-Ограничение анализа метилирования.

ДНК из опухолей толстой кишки, клеточные линии, и нормальной слизистой толстой кишки обрабатывали бисульфитом как сообщалось ранее (9) . Праймеры конструировали для амплификации метилированной и неметилированная аллелей в равной степени. Праймеры, используемые для ПЦР Versican , 5'-TTATTAYGTTTTTTATGTGATT-3 '(V1) и 5'-ACCTTCTACCAATTACTTCTTT-3' (V2). Десять к 20 мкл амплифицированные продукты расщепляли ферментами рестрикции, которые отличают метилированный от неметилированная последовательностей, как сообщалось ранее (11 , 12) , подвергали электрофорезу на 3% агарозном или 5% гели акриламид, и визуализировали путем окрашивания бромистым этидием.

Предыдущий разделСледующий раздел

Результаты

Обнаружение Метилированные CpG островами при помощи MCA.

Принцип, лежащий MCA предполагает усиление близко расположенных метилированном Sma Я сайтах для обогащения метилированном CpG островов.Методика MCA, приведена на рис. 1 ⇓ . Около 70-80% CpG острова содержат по крайней мере двумя близко расположенными (<1 Кб) Sma Я сайтах (CCCGGG).Только те Sma I сайты в этих коротких расстояниях может быть амплифицированы с использованием MCA, обеспечивая представление наиболее CpG-богатых последовательностей. Вкратце, ДНК переваривают Sma I, который режет только неметилированная сайты, в результате чего тупыми концами между С и G. Затем ДНК расщепляли с помощью Sma I изошизомером Xma I, который не разрезать метилированный CCCGGG сайты и который выходит четыре базы свес. Адаптеры лигируют к этим выступом, а ПЦР проводили с использованием праймеров, комплементарных этих адаптеров. Амплифицированной ДНК затем наносили на нейлоновую мембрану и может быть гибридизовали с любым зондом, представляющих интерес.

В качестве модельного эксперимента амплификации p16 ген CpG острова было рассмотрено, потому что: ( ) гиперметилирование этом CpG острова в раковых хорошо охарактеризованы и коррелирует с глушителей гена (17) и ( б ) эта CpG островок содержит две тесно расположенных Sma I сайты (400 пар оснований), который может быть усилен MCA. Первоначально реакция была оптимизирована путем тестирования различных праймеров с переменным содержанием GC и различные условия ПЦР. Как показано на рис. 1 B ⇓ с использованием праймеров с 70%-ным содержанием GC, p16 CpG острова усиливается сильно в Сасо2 клеточной линии, где, как известно, гиперметилированы, а отсутствие сигнала над фоном не было обнаружено от любой нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Для изучения количественной стороны MCA, ДНК из Сасо2 и нормальной слизистой толстой кишки были смешаны в различных пропорциях до MCA, и уровень метилирования каждого смешивания была определена с использованием MCA. Как показано на рис. 1 B ⇓ , MCA обнаружены p16 метилирования в полуколичественную образом от 1% до 100% метилированном аллелей. Наконец, MCA была выполнена на 109 образцах нормальной слизистой оболочки толстой кишки и соседних первичных колоректальных опухолей, которые были набраны ранее для p16 метилирование Саузерн-блот-анализа (19) . MCA и Саузерн-блоттинга были согласованы в 107 из 109 (98%) случаях (данные не показаны). В одном случае, MCA обнаружен низкий уровень метилирования (5-10%) в раковой образца, который был отрицательным судили Саузерн-блоттинга. В другом случае несогласный (MCA положительными, отрицательными Саузерн-блот), несоответствие может быть связано с гетерогенным p16 метилирования.

Идентификация дифференциально Метилированный CpG островов в колоректального рака на MCA / RDA.

Идентификация новых CpG островов аберрантно метилировано в колоректальный рак, мы использовали RDA, техника, которая была разработана для клонирования небольших различий между геномами (18) . RDA является метод, вычитание, которая опирается на гибридизации двух геномов интерес (тестер и водитель), с последующим ПЦР-амплификации последовательностей тестер, который не гибридизуется с водителем ДНК. В этом исследовании, MCA был использован для обогащения гиперметилированных CpG островов, и RDA был использован для выявления тех, которые являются исключительно метилировано в рак. RDA проводили на ампликонов MCA из клеточной линии рака толстой кишки Сасо2 как тестер, и смесь ДНК из нормальной слизистой оболочки толстой кишки пяти различных мужчин (чтобы избежать клонирование полиморфных Sma I-сайтов или неактивным и метилированный Х-хромосоме генов у женщин) в качестве водителем.Две отдельные эксперименты проводились, одна с использованием меньшего температуры отжига (72 ° С), а другой с использованием более высокой температуры отжига (77 ° С) и более GC-богатый праймеров для амплификации GC-богатых последовательностей. После двух раундов RDA продукты ПЦР были клонированы, и колонии, содержащие вставки были определены с помощью ПЦР. На основании начальных экспериментов, мы ожидали, большинство из восстановленного клоны содержат Alu-повторяющихся последовательностей, которые являются CG богатым и гиперметилированных (20) . Все клоны поэтому зондировали фрагментом Alu, и только nonhybridizing клоны анализировали далее. 160 Non-Alu клонов, 46 были независимыми клонами, и 33 из них (MINT1-33), казалось, дифференциально метилировано в Сасо2 клетки путем сравнения гибридизации с MCA изделий из Сасо2 и нормальной толстой кишки (рис. 1 С ) ⇓ . Девятнадцать из клона (MINT1-19) были получены с использованием нижней температуры отжига и 14 (MINT 20-33) были получены с использованием более высокой температуре.

Чтобы подтвердить достоверность MCA, дифференциальное метилирование было подтверждено Саузерн-блот-анализа во всех случаях (рис. 1 D ⇓ и данные не показаны). Все 33 клонов гиперметилированы Сасо2 по сравнению с нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Из этих 33, один клон (MINT13) обнаружили высокую повторяющихся последовательностей, и два клона (MINT18 и MINT28), как представляется, соответствуют мягко повторяется семейств генов (данные не показаны). Все другие, казалось обнаружения зеркальных копий фрагментов ДНК.

Секвенирования ДНК, мы обнаружили, что 29 клонов были GC содержанием> 50% и удовлетворил минимальные критерии для CpG острова (200 б.п., GC содержанием> 50%, CpG / GpC> 0,5; Ref. 21 ). Как и следовало ожидать, полученных клонов с более высокой температурой отжига и более GC-богатый праймеры имели относительно более высоким содержанием GC (табл. 1) ⇓ . Размер каждого клона, процент GC нуклеотид, CpG / GpC, гомология последовательностей, хромосомные месте, и номера GenBank, суммированы в таблице 1 ⇓ . MINT5, MINT8, MINT11, MINT14 и MINT16 содержащиеся GC-богатые регионы только в один конец клонов, и эти могли быть возмещены от края CpG островов.

Просмотр этой таблице:

• В этом окне

 

• В новом окне

Таблица 1

Краткое изложение 33 дифференциально метилированные клонов, выделенных на MCA-RDA

По гомологии ДНК поиска с использованием программы BLAST, 6 клонов были идентичными последовательностей генов человека, 4 клоны были идентичны CpG острова случайно последовательности из библиотеки CpG острова (22) , 1 был идентичен EST, 3 клонов были идентичными высокой пропускной геномных последовательностей на хранение в GenBank, 3 было значимой гомологии с другими генами, а другие 19 не оказывает значительного матча в базе данных; MINT8 была идентична PAX6 усилитель, MINT11 была идентична экзон 1 и интрон 1 человекаVersican гена и соответствовали к 3'-края промотор, связанных CpG острова; MINT14 была идентична экзона 1 человеческий α-тубулина и ген был также 3 'край CpG острова; MINT 24 соответствует некодирующей области 3' человека ген гомеобоксаCSX ; MINT21 была область с 94% гомологией на уровне нуклеотидов в экзоне 2 мышь OPT гена и, вероятно, представляет человеческий гомолог этого гена, и MINT28 была гомологична последовательности гена рибосомной (рис. 2 ⇓ ; суммированы в Таблица 1 ⇓ ). Чтобы проверить наличие потенциальных последовательностей промотора в этих клонов, промоутер предсказание проводили с использованием нескольких компьютерных программ. Двадцать из 33 клонов были предсказаны как промоторы помощью программы Нововоронежской АЭС, а шесть были предсказаны как промоторы с помощью TSSG программы.

Просмотр увеличенной версии:

• В этой страницы

 

• В новом окне

• Скачать как слайдов PowerPoint

Рис. 2.

Связь между выделенных клонов и известных генов. Три из этих генов, геномная последовательность доступна от GenBank показаны. Короткие вертикальные линии , позиции динуклеотиды CpG. Заполненые, экзонов. Для CSX ген, кДНК показана в прямоугольной коробке . Бары в верхней , положение клонов мяты.

Хромосомный положение большинства неизвестных клонов была определена с использованием соматических клеток гибридный панель и панель излучение гибридный (табл. 1) ⇓ . Следует отметить, что и MINT3 MINT9 отображается на хромосоме 1p35-36, MINT13 отображается на 7q31, MINT24 отображается на 3p25-26, MINT25 отображается на 22q11-тер, и MINT31 отображается на 17q21. Все эти сегменты хромосомной области, которые часто удален в различных опухолей (23) .

Молчание Versican гена в колоректального рака.

Для определения того, некоторые из этих клонов действительно представлены гены замолчать метилирование, мы рассмотрели Versican гена более подробно. Versicanпредставляет собой секретируемый гликопротеин, который, как представляется, регулируются RB1 гена-супрессора опухоли (24) . MINT11 соответствует часть экзона 1 и части интрона 1 Versican гена (рис. 2) ⇓ . Гиперметилирование два Sma I сайты в экзоне 1, интрон 1 в толстой линии раковых клеток было подтверждено как Саузерн-блоттинга и MCA (данные не показаны). Мы предположили, что это было метилирования представителем всего CpG острова, в том числе проксимального промотора. Для решения этого вопроса мы использовали ПЦР бисульфита обработанной ДНК с использованием праймеров, сконструированных для усиления области вокруг старта транскрипции этого гена. ПЦР-продукт затем расщепляли ферментами рестрикции, которые отличают метилированный от неметилированная ДНК (фиг. 3 ) ⇓ . Versican промотор был найден, чтобы быть полностью метилированный в толстой кишке клеточных линий рака DLD1, LOVO, SW48 и SW837 и частично метилированные в НСТ116 и НТ29 (рис. 3 Б ) ⇓ . В первичных опухолей толстой кишки, Versican был гиперметилированы в 17 из 25 случаев (68%, рис 3. B ⇓ ). Интересно, что некоторые метилирование Versican промотор был также найден в нормальных тканях, хотя и на более низком уровне по сравнению с опухолями. Уровень метилирования в нормальной слизистой оболочки толстой кишки увеличивается с возрастом пациента (фиг. 3, B и C ) ⇓ , в среднем с 6,9% у пациентов от 20 до 30 лет, в среднем 28,9% у пациентов> 80. Линейный регрессионный анализ выявил значимую связь между возрастом и Versicanметилирования промотора ( R = 0,7, P <0,000001). С помощью RT-PCR, мы затем исследовали экспрессию Versican в нормальной слизистой оболочки толстой кишки и толстой клеточных линий рака. Как показано на рис. 3 D ⇓ , Versican выражается в нормального эпителия толстой кишки, но заметно подавляется или отсутствует в метилированном линий клетки рака толстой кишки. Выражение Versican во всех этих клеточных линий было легко восстановить после обработки деметилирования агентом 5-аза-2'-дезоксицитидин (фиг. 3 D ) ⇓ . Эти данные позволяют предположить, что Versican становится метилировано в нормальном толстой кишки в возрасте-зависимым образом, и что это приводит к потере гиперметилированием и выражения в большинстве опухолей толстой кишки.

Просмотр увеличенной версии:

• В этой страницы

 

• В новом окне

• Скачать как слайдов PowerPoint

Рис. 3.

Гиперметилирование и утрату экспрессии Versican гена в колоректального рака. , картаVersican первый экзон гена (заполненный ящик ) и фланкирующие области. Top , CpG-сайтов. стрелки , размещение праймеры, используемые для бисульфит-PCR. Метилированный аллелей перевариваются до 162 и 37 п.н. ферментом рестрикции Taq I.Неметилированные аллелей остается непереваренной из-за отсутствия этого сайта после бисульфит преобразование неметилированная цитозин. B , Versican метилирование при колоректальном раке и нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Бисульфит обработанной ДНК амплифицировали с использованием праймеров V1 и V2. ПЦР-продукт (199 п.о.), расщеплялиTaq I и подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле. Taq I расщепляет только метилированную аллель, получая полосы при 162 и 37 пар оснований (п.о. 37 не видна с помощью электрофореза в агарозном геле). Гиперметилирование Versican ген был обнаружен в большинстве случаев колоректального рака испытанных клеточных линий ( верхний ) и 70% первичного колоректального рака (T1, T2 и T4-6;средняя панель ). N , нормальной толстой кишки, Т , опухоли толстой кишки. Метилирование Versican был также обнаружен в нормальной слизистой оболочки толстой кишки и постепенно увеличивается с возрастом ( нижняя панель , все образцы от нормальной слизистой оболочки толстой кишки, возраста пациента указано на верхней каждой полосе). Процент Versican метилирование (показан на дно каждой полосе) определяли путем сравнения интенсивности полос, полученных из метилированного (162 п.н.) и неметилированная (199 п.н.) аллелей. С , возрастные метилирование Versican в толстой ткани. Столбцы , среднем проценте метилирования для каждого десятилетия; бары , SEM.Количество исследованных образцов для каждого десятилетия 4, 6, 3, 6, 4, 9, 10 и 4, соответственно. D , экспрессия Versican ( V ) в толстой ткани.Versican выражение было определено методом ОТ-ПЦР в нормальном двоеточие ( слева ), полуметилированный клеточных линий (НСТ116 и НТ29), высоко метилированный клеточных линий (LOVO, SW48, SW837, РКО, CEM, RAJI, DLD1, Сасо2 и SW480) и клеточные линии колоректального рака обрабатывают метилирование ингибитор 5 -аза-2'-дезоксицитидин ( тр ). Все реакции контролируемой комнатной температуре (-) образцов (данные не показаны). КДНК амплифицировали с использованием также глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы праймеров ( G ) для проверки целостности РНК. Размер продуктов ПЦР 292 п.о. для Versican и 306 п.н. для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ( GAPDH ). Следует отметить, что все высоко метилированный клеточные линии имеют очень низкие уровни экспрессии (по сравнению с нормальной толстой кишки), а также, что это выражение значительно увеличена путем обработки метилирование ингибитор (правый ).

Предыдущий разделСледующий раздел

Обсуждение

MCA является новым ПЦР-метод, который позволяет для быстрого обогащения гиперметилированных CG-богатых последовательностей с высоким представление метилированный CpG островов. Этот метод может иметь несколько потенциальных применений. MCA может быть полезным для определения статуса метилирования большое количество образцов на нескольких локусов относительно быстро. За счет оптимизации условий ПЦР, она должна быть легко приспособлены к изучению статуса метилирования любой ген, который имеет две близко расположенные Sma I сайтами. Здесь показано, что существует очень высокий согласования скорости между МСА и другие методы для обнаружения гиперметилирование, например, Саузерн-блоттинга и бисульфит на основе методов. Однако, по сравнению с другими методами, MCA имеет некоторые недостатки в том, что: ( ) это требует хорошего качества ДНК, за исключением изучение парафин образцов; ( б ) он рассматривает только ограниченное количество CpG-сайтов в пределах CpG острова; и ( C ) оно чувствительно к неполному перевариванию помощью метилирования чувствительных фермент Sma I. Тем не менее, многие шаги в MCA поддаются автоматизации и, позволяя за рассмотрение множества генов относительно быстро, это может иметь важные приложения в популяционных исследованиях метилирования CpG острова.

Важным применением MCA в открытие нового гена гиперметилированы рака. Как показано здесь, MCA в сочетании с RDA является быстрое и мощное технологии для этой цели и выгодно отличается от других описанных методов (13 , 14 , 15 , 16) .В дополнение к идентификации генов гиперметилированы рак, MCA потенциально могут быть использованы для нахождения новых отпечатанных генов использованием партеногенетическая ДНК, а также новые гены Х-хромосомы.

Использование MCA / RDA, 33 дифференциально метилированные клонов идентифицированы и охарактеризованы более подробно. Путем секвенирования, мы обнаружили, что 29 из 33 клонов удовлетворяющим критериям CpG островов, демонстрируя, что может представлять MCA CpG островов в частности. Из них 29 клонов, 6 уже были известны гены ( PAX6 , Versican , α-тубулина , CSX , OPTгомологов и рРНК).

Из известных генов восстановлены в этом исследовании, Versican самое интересное, что эта протеогликане RB1 индуцируемого гена (24) , предполагая, что снижение экспрессии этого гена продукт может иметь важную роль в колоректального канцерогенеза, где RB мутации редки . Хотя отношение междуVersican и рак впервые был описан для гипометилирование этого гена с участием nonpromoter область (25) , наши данные ясно показывают, что аномальное метилирование из Versican промотора гена коррелирует с глушителей этого гена.Здесь мы также показываем, что промоутер метилирования Versican связано со старением в нормальной слизистой оболочки толстой кишки. Это похоже на другие гены сообщалось, метилированный в зависимости от возраста при нормальной толстой кишки, включая ER (5) , IGF2 (26) , MyoD и N33 (27) . Хотя функциональное значение возрастных метилирования сих пор не ясно, мы предположили, что он представляет собой тип поля дефекта в толстой кишке, что отчасти объясняет драматическое возрастное увеличение заболеваемости раком толстой (5) .

Метилирование CSX и OPT гены не совпадает с концом их 5 'и поэтому не ожидал, чтобы заставить замолчать этих генов. Это возможно, однако, что эти CpG островов связаны с альтернативной транскриптов генов или с другими соседними генами, которые затем будут подавлены метилирования (28) . Тем не менее, эти данные подтверждают предыдущие исследования показали, что гиперметилирование рак не всегда связаны с промоутером связанных CpG острова (29) . PAX6 является ген участвует в развитии глаза, что интересно, также была включена в дифференциально метилировано рака с использованием произвольно грунтовка- ПЦР (29) . В этом исследовании CpG острова был восстановлен в кодирующей области гена, тогда как MINT8 соответствует PAX6 усилитель представит в 5'-области гена. МетилированиеPAX6 усилитель, вероятно, влияют на его транскрипцию. Однако неизвестно, является ли этот ген экспрессируется в нормальных толстой ткани. Наконец, метилирование рибосомных генов был замечен ранее в стареющих тканях (30) и поэтому не удивительно, в раках.

Значение метилирования другие клоны, полученные в этом отчете, не ясно.Метилирование некоторые из них могут просто отражать глобальное перераспределение 5-метилцитозина во время развития рака (6 , 7) с небольшим функциональной значимости. Однако, поскольку некоторые из клонов восстановлены в экзоне 1 область экспрессируемых генов, идентификации новых генов-супрессоров опухолей может быть облегчено с помощью MCA / RDA клонов в качестве зондов для скрининга библиотек кДНК. Более того, на основе их хромосомы расположение, несколько клонов отображаются на хромосомные области полагают, питают гены-супрессоры опухолей, поскольку они сильно удален в различных опухолей ( например , хромосомы 1p35, 3p25-26, 7q31, 17q21 и 22q11-тер).

В заключение, мы разработали MCA, новый способ избирательно усиливать метилированном CpG островов. Использование в сочетании с MCA RDA, 33 клонов дифференциально метилировано в колоректального рака были выделены, в том числе несколько известных генов. Эти клоны будут полезны маркеров для идентификации новых генов подавлен гиперметилирование раком, а также может быть полезна маркеров для ранней диагностики и прогнозирования прогноза при раке прямой кишки.

Предыдущий разделСледующий раздел

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Университета Джонса Хопкинса Основные Секвенирование фонда за отличную техническую помощь.

Предыдущий разделСледующий раздел

Сноски

• Расходы на публикацию этой статьи были покрыты частично выплату страницы обвинений. Эта статья должна быть поэтому настоящим отмечены рекламы в соответствии с 18 USC 1734 Раздел исключительно для обозначения этого факта.

• ↵ 1 Работа выполнена при поддержке Национального института рака и гранты CA77045 CA54396 и рака толстой кишки Spore Грант CA62924 от NIH. МТ докторской парень из Японии Общество содействия развитию науки. NA поддерживается NIH обучения Грант 1-T32-DK07713. JP. СО является выпускником школы Kimmel Foundation.

• ↵ 2 Кому запросы на оттиски должны быть рассмотрены на Джона Хопкинса онкологического диспансера, 424 Северной Bond Street, Baltimore, MD 21231.Телефон: (410) 955-8506, факс: (410) 614-9884 или по электронной почте:jpissa@welchlink.welch.jhu.edu.

• ↵ 3 сокращений, используемых являются: СМА, метилированный CpG острова усиления; RDA, репрезентативный анализ разницы; ОТ-ПЦР с обратной транскрипцией ПЦР; MINT, метилированный в опухолях.

• Поступила в редакцию 4 февраля 1999.

• Принято 30 марта 1999.

• © 1999 Американской ассоциации по исследованию рака.

Предыдущий раздел

 

Ссылки

1. ↵ 

Kinzler KW, Vogelstein В. Уроки Наследственные колоректального рака.сотовый , 87 : 159 -170, 1996 .

 

CrossRefMedline

2. ↵ 

Антекера Ф., А. Птица Количество CpG островов и генов человека и мыши.Proc. Natl. Акад. Научно. США , 90 : 11 995 -11 999, 1993 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

3. ↵ 

Латам KE X импринтинга и инактивации хромосомы в начале эмбриона млекопитающих. Тенденции Жене. , 12 : 134 -138, 1996 .

 

CrossRefMedline

4. ↵ 

Барлоу DP гаметическое импринтинга у млекопитающих. наук (Вашингтон, округ Колумбия) , 270 : 1610 -1613, 1995 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

5. ↵ 

Исса JP, Октавиан Ю.Л., Celano П., Гамильтон SR, Дэвидсон СВ, Baylin SB метилирования рецептора эстрогена CpG острова ссылки старения и новообразований в толстой кишке человека. нац. Жене. , 7 : 536 -540, 1994 .

CrossRefMedline

6. ↵ 

Baylin SB, Герман JG, Graff JR, Vertino PM, Исса JP Изменения в метилирование ДНК: фундаментальный аспект неоплазии. Adv. Cancer Res. , 72: 141 -196, 1998 .

 

Medline

7. ↵ 

Schmutte C., Jones PA Участие метилирования ДНК в канцерогенезе человека. Biol. Chem. , 379 : 377 -388, 1998 .

8. ↵ 

Makos Уэльса М., Biel М.А., EL Deiry W., Нелькин BD, Исса JP, Cavenee WK, Kuerbitz SJ, Baylin SB р53 активирует экспрессию HIC-1 , новый кандидат супрессоров опухолей ген на 17p13.3. нац. Med. , 1 : 570 -577, 1995 .

CrossRefMedline

9. ↵ 

Кларк SJ, Харрисон Дж., Пол CL, Frommer М. Высокая чувствительность отображение метилированном цитозина. нуклеиновых кислот. Res. , 22 : 2990-2997, 1994 .

 

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

10. ↵ 

Герман JG, Graff JR, Myohanen С., Нелькин BD, Baylin SB специфической в отношении метилирования ПЦР. Роман ПЦР для статуса метилирования CpG островов. Proc. Natl. Акад. Научно. USA , 93 : 9821 -9826, 1996 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

11. ↵ 

Садри Р., Хорнсби PJ Экспресс-анализ метилирования ДНК с использованием новых рестриктаз сайты, созданные бисульфита модификации.Res нуклеиновых кислот. , 24 : 5058 -5059, 1996 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

12. ↵ 

Сюн З., Лэрд PW Cobra:. Чувствительной и количественного анализа метилирования ДНК нуклеиновых кислот Res. , 25 : 2532 -2534, 1997 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

13. ↵ 

Gonzalgo ML, Лян Г., Spruck CH, III, Зингга JM, Rideout WM, III, Jones PA Идентификация и характеристика дифференциально метилировано регионах геномной ДНК путем метилирования чувствительных произвольно загрунтовать ПЦР. , Cancer Res. , 57 : 594 -599, 1997 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

14. ↵ 

Хуан TH, Laux DE, Хэмлин до н.э., Чан П., Х. Чан, Lubahn DB Идентификация маркеров метилирования ДНК для человека раком молочной железы помощью метилирования-чувствительный метод дактилоскопии ограничений. , Cancer Res. , 57 : 1030 -1034, 1997 .

 

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

15. ↵ 

К Акама, Окадзаки Ю., Ито М., Okuizumi Х., Конно Х., М. Muramatsu, Plass С, состоявшемся WA, Хаясидзаки Y. Ограничение достопримечательностью геномной сканирования (RLGS-M) на основе генома сканирования мыши . опухоли печени для изменений в статусе метилирования ДНК Cancer Res. , 57 :3294 -3299, 1998 .

 

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

16. ↵ 

Ushijima Т., К. Morimura, Hosoya Ю., Okonogi Х., М. Tatematsu, Sugimura Т., М. Nagao Создание метилирования-чувствительный анализ разницы представительских и изоляции гипо-и гиперметилированных геномных фрагментов опухоли в печени мышей. Proc. Natl. Акад. Научно. USA , 94 : 2284-2289, 1997 .

 

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

17. ↵ 

Герман JG, Мерло А., Мао Л., Лапидус Р.Г., Исса JP, Дэвидсон СВ, Sidransky Д., Baylin SB инактивация CDKN2 / P16 / MTS1 гена часто связано с нарушения метилирования ДНК во всех общих злокачественных опухолей человека. Cancer Res . , 55 : 4525 -4530, 1995 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

18. ↵ 

Лисицын Н., Н. Лисицын, М. Wigler Клонирование различия между двумя сложными геномами. наук (Вашингтон, округ Колумбия) , 259 : 946 -951, 1993 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

19. ↵ 

Ahuja Н., Мохан А.Л., Ли В., Столкер JM, Герман JG, Гамильтон SR, Baylin С.Б., Исса JP ассоциации между метилирования CpG острова и микроспутник нестабильности в колоректального рака. Cancer Res. , 57 : 3370 -3374, 1997 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

20. ↵ 

. Kochanek С., Renz Д., Doerfler W. метилирования ДНК в последовательности Alu диплоидных и гаплоидных первичных человеческих клетках EMBO J. , 12 : 1141 -1151, 1993 .

 

Medline

21. ↵ 

Гардинер-сада М., М. Frommer CpG островов в геномах позвоночных. J. Mol.Biol. , 196 : 261 -282, 1987 .

 

CrossRefMedline

22. ↵ 

Крест SH, Чарльтон JA, Нан X., Птица AP Очистка острова CpG метилированном использованием ДНК-связывающие колонки. нац. Жене. , 6 :236 -244, 1994 .

 

CrossRefMedline

23. ↵ 

Мертенс Ф., Йоханссон Б., М. Хогланд, Мительман F. хромосомный дисбаланс карт злокачественных солидных опухолей: цитогенетического обследования 3185 новообразований. Cancer Res. , 57 : 2765 -2780, 1997 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

24. ↵ 

Rohde М., Warthoe P., Gjetting Т., Lukas J., J. Bartek, Штрауса М. белок ретинобластомы модулирует экспрессию генов, кодирующих различных классов белков, включая компоненты внеклеточного матрикса. Oncogene , 12 :2393 -2401 , 1996 .

 

Medline

25. ↵ 

Adany Р., Iozzo RV Измененные метилирования Versican гена протеогликан в карциномы толстой кишки человека. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 171 :1402 -1413, 1990 .

 

CrossRefMedline

26. ↵ 

Исса JP, Vertino PM, Бем CD, Newsham И.Ф., Baylin SB Переход от моноаллельную к биаллельных человека IGF2 метилирования промоутера в процессе старения и канцерогенеза. Proc. Natl. Акад. Научно. США , 93 : 11 757 -11 762, 1996 .

 

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

27. ↵ 

Ahuja Н., Ли В., Мохан А.Л., Baylin С.Б., Исса JP Старение и метилирования ДНК в слизистой оболочке толстой и рак. Cancer Res. , 58 : 5489 -5494, 1998 .

Абстрактные / БЕСПЛАТНО Полный текст

28. ↵ 

Маклеод Д., Али RR, Птица А. альтернативных промоутером в мышь главного комплекса гистосовместимости класса II I-Ар ген: последствия для происхождение CpG островов. Mol. Cell. Biol. , 8 : 4433 -4443, 1998 .

29. ↵ 

Лян Г., Salem CE, MC Ю., Нгуен HD, Гонсалес FA, Нгуен TT, Николс PW, Jones PA метилирования ДНК разниц, связанных с опухолевыми тканями определены сканирования генома анализа. геномики , 53 : 260 -268, 1998 .

CrossRefMedline

30. ↵ 

Swisshelm К., Disteche CM, Торвальдсена J., Нельсона, Солка Д. Возрастные увеличение метилирования рибосомных генов и инактивации хромосомы конкретного гена рРНК кластеров в мыши. Mutat. Res. , 237 : 131-146, 1990 .

 

CrossRef