3. Приготовление гипериммунных сывороток.

Технологическая схема приготовления гипериммунных сывороток.

Приготовление антигена		Подбор животных продуцентов и их карантирование
	Грандиммунизация
	Отбор животных-продуцентов
	Гипериммунизация животных-продуцентов
	Получение гипериммунной сыворотки
Получение нативной сыворотки			Очистка и концентрирование сыворотки
	Консервирование
	Отстаивание сыворотки
	Фильтрация через пластины Ф и СФ
	Контроль

Сыворотку получают методом цитрирования крови с последую­щим сепарированием и дефибринированием плазмы.

Сыворотку крови консервируют 0,5 %-ным раствором фенола и от полноты адсорбции антител.

При получении большинства противовирусных гипериммунных сывороток используют антигены без адъювантов, отстаивают в специальных емкостях в течение двух месяцев. Отсто­явшуюся сыворотку фильтруют вначале через пластины Ф, а затем через стерилизующие пластины СФ.

В последующем сыворотку расфасовывают во флаконах емкос­тью по 100 мл. Флаконы закрывают пробками и для герметичности их обкатывают алюминиевыми колпачками. На флаконы наносят эти­кетку и часть продукции сдают на контроль.

Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путем удалеформенных элементов и фибрина, называются нативными (в отличие сывороток, подвергнутых дополнительной очистке и концентрации специальными методами).

Этапы получения гипериммунных сывороток.

Цитрирование	Сепарирование	Дефибринирование
Концентрирование 0,5 % -ным раствором фенола
Отстаивание в течение 2 месяцев	Стерилизующая фильтрация	Фасовка во флаконы
		Контроль

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них ак тивных белковых фракций (преимущественно гамма-глобулинов) и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител (например, альбумины).

Выделенные фракции растворяют в меньшем объеме растворите ля, по сравнению с исходным объемом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить в меньших дозах.

Необходимость в получении концентрированных сывороток связана:

• со значительными объемами выпускаемых лечебных сывороток исчисляемыми сотнями тонн. Для расфасовки сывороток требуете: большое количество флаконов, пробок, колпачков, ящиков для упаковки. Кроме того, большие затраты уходят на транспортировку такого объема сывороточных препаратов

• с недостаточно высокой активностью отдельных сывороток, ко торые вводятся животным в больших дозах (с профилактической целью - по 20 - 60 мл, с лечебной - по 40 - 120 мл). Уменьшения общего объема выпускаемых сывороток и повышения их активности можно достигнуть путем их очистки и концентрации иммуноглобулинновой фракции гипериммунной сыворотки.

В производственных условиях очистку и концентрацию сыворо­ток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим:

• ферментативный гидро­лиз;

• прогрев ферментированных сывороток в кислой среде;

• солевое фракционирова­ние;

• дополнительную очистку от неактивных белков с ис­пользованием органических растворителей, сорбентов;

-дополнительное выдерживание сывороток при пониженных температурах.

При такой обработке удаляется до 80 - 85 % балластных белков сыворотки.

Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. Для этого используются ультра­фильтрационные модули на полых волокнах, отличающихся преде­лом задержания по молекулярной массе: 5000, 15000, 50000, 100000 дальтон. В соответствии с этим, в биопромышленности используют­ся модули УФУ-5, УФУ-15, УФУ-50, УФУ-100.

Для задержания гамма-глобулинов лучше всего использовать УФУ100, обеспечивающую практически полную задержку гамма-глобу­линов на фильтре, так как молекулярная масса гамма-глобулинов составляет 160000 - 900000 дальтон.

Производственные опыты по ультрафильтрации сывороток дали возможность сконцентрировать их в 3 раза и практически без потерь иммуноглобулинового компонента. Это позволяет сократить объем сывороточных препаратов в 3 раза и во столько же раз повысить их удельную активность.

Более того, ультрафильтрат, который в основном представлен аль­буминовой фракцией, может быть использован в качестве компонен­та питательной среды для выращивания микроорганизмов, а также как протеиносодержащий препарат для лечения животных.

Отечественный метод приготовления сыворотки, известный под названием «Диаферм-3» (диализ, ферментация), был разработан в 1954 г. и затем усовершенствовался.

Метод «Диаферм-3» включает восемь стадий:

• стадия ферментативного гидролиза сывороточных белков пепсином в течение 1 ч при рН 3,2 и 1 ч при рН 4,2 при температуре 22 -25 °С;

• стадия термоденатурации в течение 45 мин, при рН 4,3 и 58 °С вприсутствии 14-14,5% сульфата аммония ;

• стадия высаливания активных глобулинов сульфатом аммония(34%) при рН 7,1;

• стадия стерилизующей фильтрации;

• стадия диализа и дополнительной очистки от балластных бел­ ков в их изоэлектрической точке при рН 5,2-5,6 в присутствии хлоро­форма (СН);

• стабилизация очищенной сыворотки в течение 3 месяцев;

• повторная стерилизующая фильтрация

• расфасовка.