Роль позитивной селекции, происходящей в кортикальном слое тимуса, заключена в отборе т-клеток, распознающих свои молекулы мнс.

Клетки, экспрессирующие TCR, но не способные распознавать собственные молекулы МНС, подвергаются апоптозу. Этот процесс получил название смерть от забвения (death by neglect). Тимоциты, которые, напротив, слишком сильно связываются с собственными молекулами МНС и могут являться причиной аутоиммунных реакций, при попадании на периферию, подвергаются элиминации в ходе негативной селекции. Распознавание тимоцитами собственных молекул МНС с низкой афинностью не только способствует их выживанию, но также обеспечивает детерминацию путей развития в клетки CD4⁺, либо CD8⁺. Распознавание DP клетками молекул МНС класса I приводит к их дифференцировке в Т-клетки CD8⁺, в то время как распознавание МНС молекул II класса – в Т-клетки CD4⁺.[7,9]

В иммунологии существует множество фундаментальных вопросов, связанных с развитием Т клеток, их селекцией, дифференцировкой и поляризацией Т клеток в ходе иммунного ответа. Учитывая тот факт, что иммунная система формирует большой репертуар Т клеток, экспрессирующих разнообразные TCR и , соответственно, обладающих различной специфичностью. Главным методом изучения фундаментальных вопросов иммунологии является создание животных, экспрессирующих трансгенный Т-клеточный рецептор (TCR) известной специфичности. Число таких моделей в современной мировой науке невелико и существует лишь ограниченное число примеров трансгенных Т-клеточных рецепторов.

Целью данной работы является клонирование T-клеточного рецептора для последующего создания трансгенных мышей с целью изучения фундаментальных вопросов иммунологии.

Материалы и методы

Всю стеклянную и пластиковую посуду автоклавировали.

Все растворы разводили на основе деионизированной воды MILLI-Q.

Метод полимеразной цепной реакции (PCR).

Сначала готовят общую смесь, которую расфасовывают по 25 мкл в 0.7 мл пробирки Эппендорфа:

Taq polymerase buffer10x	2.5мкл
MgCl2 (25 mM)	2.5 мкл
DNTP	0.2 мкл
Праймеры	0.625
Taq polymerase	0.2 мкл
Вода	18.35 мкл

Первоначально в смесь добавляют воду, в последнюю очередь в смесь добавляют полимеразу. В реакционную смесь добавляют 50 мкл вазелинового масла.

Праймеры на β цепь:

TCRBV6S1 BamHI 5΄- cagaggatccagaaagtccctccaaact- 3΄

TCRBJ2S7 SacII 5΄-gcttccgcggtcctaattaattct-3΄

Праймеры на α цепь:

TCRADV11S4 Sma I 5΄- gccctgctgactgttggaaatcagcatcttgacagggtcaatg- 3΄

TA144 Sac II R 5΄-ctgtgggcccagatcttcttgacagggtca-3΄

Все реагенты хранятся при -20⁰С.

Все буферы и ферменты, кроме MgCl₂, были предоставлены фирмой FERMENTAS. MgCl₂ был приобретен у фирмы Диа М и приготовлен собственноручно.

Список использованной PCR программы для амплификации α β цепей ТCR:

1. 95⁰С – 2 мин.

2. 30 циклов со следующими режимами:

• 95⁰С – 1 мин.

• 55⁰С – 1 мин.

• 72⁰С – 1 мин

3. 72⁰С – 10 мин.

Электрофорез в агарозном геле.

Электорофорез проводили в 1.5% по массе агарозном геле (Диа М) под напряжением 110-120 В.

Сначала формочку для геля с установленным количеством гребенок заливали 75 мл 1.5% агарозы, которую предварительно растворяли в 1х ТАЕ буфере путем разогревания. Когда гель застыл, гребенки осторожно вынимают, а формочку опускают в ванну с ТАЕ буфером. Перед нанесением проб каждую из них перемешивают с 5 мкл красителя на основе бромфенолового синего, содержащего 40% по массе сахарозы. После нанесения проб к ванночке подключают напряжение.

Анализ и фотографирование геля осуществляли при помощи трансиллюминатора с подключенной к нему видеокамерой с использованием программы FlyVideo.

ТАЕ буфер: 0.04М Tris-acetate

0.001M EDTA

Краситель (храниться при -20⁰С)

Наращивание плазмидной ДНК.

ДНК плазмидных векторов хранится при -70⁰С в трансформированных ею Z-компетентных клетках E. Coli (Zymo Research). Сток представляет собой смесь 1:1 компетентных клеток, содержащих плазмидную ДНК и глицерола (Sigma). Посев компетентных клеток осуществлялся на 100 мм чашки Петри с 20 мл застывшей среды LB AGAR (GIBCO) с добавлением селектирующего антибиотика в концентрации, указанной фирмой-производителем. В случае векторов – pTZ57R вектор, рТα, рТβ использовали ампицилин в концентрации 30 мг/мл. В случае pTZ57R вектора в среду LB AGAR добавляли X-Gal (β-галактозидаза) и IPTG (активатор транскрипции β-галоктозидазного гена). Чашку Петри переворачивали вверх дном и инкубировали в термостате при 37⁰С в течение ночи. На следующий день в стерильных условиях отбирали несколько колоний. Компетентные клетки наращивают в 60 мл стерильной среды LB (GIBCO) с селектирующим антибиотиком. Компетентные клетки растили 16-18 часов при 37⁰С при постоянном перемешивании на шейкере (скорость 200 оборотов в минуту). По прошествию данного интервала времени клетки осаждали в центрифужных пробирках на 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок использовали для выделения ДНК.

Для сиквенирования и рестрикционного анализа плазмиду наращивали в 2 мл LB среды с добавлением антибиотика.

LB AGAR (GIBCO) содержит 0.2 г триптона

0.1 г дрожжей

0.1 г хлористого натрия

0.1 г агара

LB среда содержит те же компоненты, но без добавления агара.

Выделение плазмидной ДНК.

К полученному путем центрифугирования осадку добавляли 1.5 мл раствора 1, ресуспендировали до гомогената и равномерно распределяли на 10 полуторокубовых эппендорффов. Через 10 мин. в каждый эпендорфф добавляли 300 мкл раствора 2 и осторожно перемешивали 3 раза. Реакцию проводят 10 мин. На льду при 0⁰С. Далее в каждую пробу добавляли 225 мкл раствора 3 и хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин. Реакцию также проводили на льду. По прошествию времени содержимое пробирок осаждали в микроцентрифуге 15 мин. При 8000 об/мин. Удаление РНК из полученного супернатанта производили при помощи рибонуклеазы А. Далее ДНК высаливали 0.1 объемом ацетата натрия и 0.8 объема изопропанола (Химмед) и центрифуговывали 20 мин. при 14000 об/мин, супернатант сливали, а осадок разбавляли в 500 мкл воды. Затем проводили экстрагирование белков с последующим, осаждением и доводили до концентрации 1 мкг/мкл.

Раствор 1: 25мМ трисHCl рН8 (Sigma)

50мМ глюкоза фирмы Диа М (исходный раствор глюкозы фильтруется и добавляется в нужной концентрации после автоклавирования раствора 1)

Раствор храниться при 0⁰С.

Раствор 2 на 10 проб: 2.64 мл воды

300 мкл 10% додецилсульфата (SERVA)

60 мкл 10N гидроокись натрия (Мос Реактив)

Раствор готовится каждый раз перед употреблением.

Раствор 3 на 100 мл: 5М ацетат натрия 60 мл (Диа М)

ледяная уксусная кислота 11.5 мл (ХИММЕД)

вода 28.5

Итоговый раствор является 3М.

Рестрикция ДНК.

Рестрикция ДНК осуществляется рестриктазами, узнающими специфические нуклеотидные последовательности. Все используемые рестриктазы с оптимальными для их работы буферами представлены фирмой FERMENTAS. Количество рестриктазы, необходимое на реакцию, рассчитывается с учетом необходимого количества ДНК для последующей работы, ее массы, исходной концентрации фермента и количества сайтов рестрикции для данного фермента у фага λ, указанного в паспорте фирмой-производителем.

Если же плазмидную ДНК необходимо выделить из геля для последующего достраивания одноцепочечных концевых фрагментов и дефосфорилирования используют 100 мкг ДНК в 100 мкл смеси. Если рестрикцию проводили с 2 ферментами, работающими в разных буферах, то ее ставили поочередно.

Для анализа плазмид на наличие вставки в реакционной смеси объемом 10 мкл добавили 5 мкл ДНК. Смесь инкубировали при +370С на 30 мин. Полученную смесь фрагментов анализировали электрофорезом в 1.5% агарозном геле.

Ферменты и маркер хранятся при температуре -40⁰С.

Выделение ДНК из легкоплавкой агарозы.

После того, как гель застыл на расстоянии 2 см по вертикали от лунки, из которой будет мигрировать ДНК, вырезали фрагмент геля. Вместо него залили 2% легкоплавкую агарозу (Bio Products, USA) и дали ей застыть. Далее формочку погружали в ванночку для электрофореза, заполненную ТАЕ буфером. В лунку наносили смесь фрагментов ДНК, размешанную с 5 мкл краски (40% по сахарозе), полученную путем рестрикции, и подключали напряжение 70-80 Вт. Когда фрагмент необходимой молекулярной массы мигрировал в легкоплавкую агарозу, электрофорез останавливали. Из геля вырезали фрагмент легкоплавкой агарозы, содержащий необходимую последовательность ДНК. ДНК экстрагировали при помощи специальных колонок (QIAGEN). Гель взвешивали, помещали в 1.5 мл пробирку и действовали по протоколу, представленному фирмой-производителем:

1. добавляли объем охлажденного изопропанола (-20⁰С)(Химмед), равный гелю, и перемешивали.

2. смесь переносили в колонку и центрифугировали.

3. супернатант удаляли, добавляли 500 мкл буфера QG и осаждали.

4. колонку промывали 750 мкл буфера и осаждали.

5. колонку помещали в чистую пробирку, добавляли 50 мкл воды и, подождав 1-2 мин., снова центрифугировали.

Осаждение проводили на микроцентрифуге при 13000 об/мин.

Достраивание концевых нуклеотидных последовательностей ДНК.

Достраивание 3´ концевых последовательностей ДНК осуществляли при помощи ДНК полимеразы I (FERMENTAS) по стандартному протоколу фирмы.

На 20 мкл раствора ДНК необходимо добавить:

10х реакционного буфера 2 мкл

2мМ смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов 0.5 мкл до конечной концентрации 0.05мМ

Кленов фрагмент (ДНК полимераза I) 3 единицы

Довести водой до 20 мкл

Инкубировать смесь при 37⁰С 10 мин.

Чтобы прекратить работу фермента, необходимо добавить 1 мкл ЭДТА (Sigma) и перемешать.

Далее осуществляли экстрагирование белков и высаживание ДНК.

Ферменты и буфера хранятся при температуре -40⁰С

Соединение вектора и вставки при помощи лигазы.

Конечная лигирующая смесь должна быть 10 мкл. Если концы вектора достраивали, то молярное соотношение между ним и вставкой было 1 к 1, а конечная суммарная концентрация их в 10 мкл смеси была 0.5 мкг. Если вектор только дефосфорилировали, то соотношение было 2 к 1, а конечная суммарная концентрация их в 10 мкл смеси была 0.05 мкг. Помимо вектора и вставки в раствор добавляли 1 мкл 10х лигазного буфера (FERMENTAS), 1 мкл полиэтиленгликоля (FERMENTAS), 0.3 мкл лигазы (FERMENTAS).

Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре.

Ферменты и буферы хранятся при температуре -40⁰С.

Трансформация компетентных клеток и высевание на чашки Петри.

Компетентные клетки хранятся на -70⁰С в пробирках Эпендорфа по 30 мкл и замораживанию не подлежат. Для начала ампулу размораживали, не нагревая. Далее в нее переносили 3 мкл лигазной смеси, хорошо перемешивали и оставляли на 1 час на льду.

Через час смесь переносили на чашки Петри с агаром и равномерно распределяли по всей площади чашки при помощи стеклянного шпателя. Данную операцию проводили на расстоянии 15 см от горелки.

Результаты

Для создания трансгенных мышей используют специально созданные кассеты pTα и pTβ, содержащие регуляторные элементы, необходимые для экспрессии α и β цепей TCR, а также С-районы для α и β цепей TCR. В кассеты pTα и pTβ введены уникальные сайты рестрикции, позволяющие осуществлять клонирование в них α и β цепей TCR.

Рис. 1 Векторы pTα и pTβ, использованные для клонирования для α и β цепей TCR.

Поскольку в плазмидах уже содержится С-район TCR, для клонирования использовали только V-районы.

В качестве источника TCR использовали гибридому 1D1, TCR которой специфичен к аллогенным молекулам МНС класса I.

Матрицей для клонирования α и β цепей TCR использовали геномную ДНК, так как J-C интрон, входящий в ее состав, возможно, включает в себя регуляторные последовательности для транскрипции или транспорта и сплайсинга мРНК.

Принимая во внимание большие размеры кассет pTα и pTβ и трудоемкость клонирования в них PCR фрагментов прибегали к промежуточной стадии. Реоранжированный геном ДНК α и β цепей TCR клонировали в кассету pTZ57R. Этот вектор удобен тем, что, во-первых: на его концах находятся липкие poly(T) последовательности, а особенностью Taq полимеразы, используемой при амплификации PCR продукта, является присоединение poly(А) последовательностей на концах амплифицируемого фрагмента. Таким образом, это облегчило лигирование вставки с вектором. Во-вторых, сайт клонирования в векторе pTZ57R находится в гене, продукт которого расщепляет β-галактозидазу. Добавляя субстрат (X-Gal) и IPTG (активатор транскрипции β-галактозидазного гена) в агар по наличию синего окрашивания и отсутствию окрашивания можно было различить колонии, не содержащие и содержащие вставку, соответственно.

Рис 2. Вектор pTZ57R, использованный для клонирования α и β цепей TCR.

Амплификацию α и β цепей TCR рецептора осуществляли методом полимеразной цепной реакции (PCR). Чтобы избежать возможных мутаций, кроме Taq полимеразы, использовали Pfu полимеразу, которая устраняет ошибки первой. Результат PCR детектировали с помощью электрофореза. Для амплификации использовали праймеры специфичные к соответствующим V и J сегментам α и β цепей TCR, и включающие в себя искусственно введенные сайты рестрикции Sma I и Sac II , в случае α цепи, и BamH I и Sac II , в случае β цепи TCR рецептора, облегчающие клонирование в кассетные векторы. Для того, чтобы определить и проанализировать последовательности V(D)J сегментов TCR, PCR фрагменты Т клеточного рецептора были заклонированы в вектор pTZ57R при помощи лигазы.

Колонии, полученные трансформацией компетентных клеток E. Сoli лигазной смесью, откалывали и проверяли на наличие вставки методом PCR. В качестве положительного контроля использовали PCR продукт Т клеточного рецептора, в качестве отрицательного контроля – пустой pTZ57R вектор.

1D1 β genome in pTZ57R vector 1D1 α genome in pTZ57R vector

Рис. 3 PCR плазмид pTZ57R содержащих геномные ДНК α и β цепей TCR. + и – обозначены позитивные и негативные по содержанию вставки клоны. М – маркер молекулярного веса.

Колонии, содержащие вектор со вставкой наращивали в 2 мл среды с последующим выделением плазмидной ДНК. Фрагменты TCR секвенировали и анализировали с помощью программы Chromas v. 1.45. Аминокислотную последовательность в реаранжированном участке определяли с помощью программы DNAssist v. 1.0. С помощью программы BLAST идентифицировали последовательности V, D, J сегментов, а также N и P нуклеотиды.

Таким образом отбирали клоны, не имеющие мутаций в α и β цепях TCR рецептора. Такие клоны наращивали в 60 мл среды и выделяли плазмидную ДНК. С целью клонирования в кассетные векторы вставку вырезали при помощи рестриктаз Sma I и Sac II , в случае α цепи, и BamH I и Sac II , в случае β цепи TCR рецептора. Для того, чтобы заклонировать β цепь TCR рецептора в вектор pTβ рестрикцию осуществляли в два этапа: сначала по сайту BamH I, после чего проводили достраивание нуклеотидов, а затем по Sac II. Таким способом получали вставку с "липким" концом по сайту Sac II , и "тупым" по сайту BamH I, благодаря чему, вставка могла встать только в позитивной ориентации. К такому способу прибегали в силу того, что β цепь содержала в своем составе сайт рестрикции Xho I, и, следовательно, осуществлять рестрикцию по этому сайту было невозможно.

После этого проводили выделение вставок (α и β цепей) из легкоплавкой агарозы.

Колонии, содержащие векторы pTα и pTβ со вставками, откалывали и наращивали в 2 мл среды, выделяли ДНК. Наличие вставки проверяли методом PCR и рестрикцией. Фрагменты TCR секвенировали и анализировали. Позитивные не имеющие мутаций колонии наращивали в 60 мл среды и выделяли ДНК.

1D1 β genome

atgaacaagtgggttttctggctgggtaaccctttgtctccttactgtaggtaaggctctgggctctctgggttcctgttgccgagtgcacatcttaacccccctgccctgggtagcagtgccaaaccccttccagactgattctttttcttttccagagaccacacatggtgatggtggcatcattactcagacacccaaattcctgattggtcaggaagggcaaaaactgaccttgaaatgtcaacagaatttcaatcatgatacaatgtactggtaccgacaggattcagggaaaggattgagactgatctactattcaataactgaaaacgatcttcaaaaaggcgatctatctgaaggctatgatgcgtctcgagagaagaagtcatctttttctctcactgtgacatctgcccagaagaacgagatggccgtttttctctgtgccagcaccccgacagaactctcctatgaacagtacttcggtcccggcaccaggctcacggttttaggtaagattcacatctctcgcttccacccaaattcctgggtccctggagtagtttggagtagaccagggttagggaatctccgggagggaaatcgatagtaggagacagctctcaacttcaccctttctgggggagcgggatgaaaagggattgggtgccaaacgttgttcgctctctcgcaagccaggacaaggtaggtttctttctcttttctctgaggtatgcatgcactgggtgggtggtgaagaaaaagaattaattaggaccgcggaagcaaacttggttttgaaaataaatagccggcacaaacccgcgggaagaatctagatgcattcgncgagacacggctagc