Обзор литературы

В окружающей нас среде присутствуют в огромном разнообразии патогенные агенты – вирусы, бактерии, грибы, простейшие и многоклеточные паразиты. Они способны вызывать заболевания и их бесконтрольное размножение, в конце концов, приводит к гибели организма. Однако в норме, благодаря иммунной системе, которая защищает организм от патогенных агентов, большинство инфекций протекает кратковременно и практически без нарушающих здоровье последствий.

Поскольку микроорганизмы существуют во множестве форм, организм располагает широким набором факторов противоинфекционной резистентности и форм иммунного ответа. [2]

Как правило, иммунный ответ заключается, во-первых, в распознавании возбудителя или иного чужеродного материала. В широком смысле все разнообразные формы иммунного ответа можно разделить на два типа — врожденный и приобретенный иммунитет. Оба вида иммунного ответа, врожденный и адаптивный, связаны с активацией белых клеток крови, или лейкоцитов.

Начальные этапы ответа на инфекцию основаны реакциях врожденного иммунитета. Он представлен у каждой особи в течение всей жизни и дифференцируется в зависимости от вида и характера патогена.

Адаптивный (специфический) иммунитет – это ответ специфических лимфоцитов на антиген, с последующей генерацией иммунологической памяти.

В развитие реакций врожденного иммунитета в основном вовлечены дендритные клетки, гранулоциты и макрофаги. Адаптивный иммунный ответ основан на популяции лимфоцитов, которые обеспечивают иммунитет в течение жизни организма вследствие перенесенной болезни или вакцинации.

Макрофаги и нейтрофилы системы врожденного иммунитета образуют первую линию защиты против микроорганизмов. Однако они не всегда могут обезвредить инфекционные агенты и не могут распознать некоторые антигены. Лимфоциты адаптивной иммунной системы вовлекаются в создание более изменчивой и универсальной защиты, и, к тому же, обеспечивают дополнительную защиту против повторной атаки патогена, уже известного организму. Клетки врожденной иммунной системы играют ключевую роль в инициации и последующей дифференцировке адаптивного иммунного ответа. [3]

Специфичность иммунитета реализуется через формирование клонов лимфоцитов с рецепторами, уникальным по своей структуре.

Характерной особенностью приобретенного иммунитета является его индуцибельность. В условиях нормы функциональная активность клона лимфоцитов незначительна. Специфические антитела либо полностью отсутствуют, либо их количество крайне мало. В то же время контакт организма с антигеном провоцирует как усиление продукции соответствующих антител так и нарастание и функциональное созревание специфического клона клеток.

Другой существенный признак адаптивной иммунной системы связан со способностью сохранять память о первой встрече с антигеном, что способствует быстрой активации и элиминации антигена при повторной встрече.[1]

В развитии специфического иммунного ответа принимают участие три основных типа клеток: В-лимфоциты, Т-лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки (макрофаги, дендритные клетки, В-клетки).

Основная эффекторная функция В-клеток – участие в формировании гуморального иммунного ответа посредством активной продукции специфических иммуноглобулинов. Значительная часть гистогенеза В-лимфоцитов происходит в костном мозге. Одной из основных особенностей В-лимфоцитов является экспрессия поверхностного иммуноглобулина IgМ, способного к специфическому распознаванию чужеродного антигена. Взаимодействие В-лимфоцита с антигеном приводит к его антигензависимой дифференцировке по двум направлениям – до активно продуцирующего антитела плазмоцита и к формированию пула В-клеток памяти.

Также В-лимфоциты способны презентировать антиген для Т-хелперов.

Т-лимфоциты участвуют в формировании так называемого клеточного иммунитета. В отличие от В-клеток, функция которых реализуется через гуморальные продукты – антитела, Т-лимфоциты разрушают чужеродные клетки (трансплантаты, опухолевые и вирустрансформированные клетки).

Подобно B-лимфоциту,T-лимфоцитнесет на своей поверхности специфический рецептор для распознаванияантигена. Однако, тогда как рецептор B-лимфоцита – это мембрансвязанный мономер Ig , рецептор T- лимфоцита представляет собой гетеродимер, состоящий из двух цепей (молекулярная масса каждой - 40-50 кДа). У всех иммунокомпетентных T-лимфоцитов антигенный рецептор нековалентно, но прочно связан в комплекс с молекулой CD3, которая состоит из пяти пептидных цепей (CD3 - γ, - δ, -ε, -ξ и -ξυ и участвует в передаче сигнала от распознающего антиген гетеродимера внутрь клетки. Логично рассматривать весь рецептор как девяти-пептидный комплекс, образованный TCR и молекулой CD3, и который может связываться с другими мембранными белками. [1]

Распознавание чужеродных клеток Т-клеточными рецепторами (TCR), может происходить благодаря тому, что чужеродные пептиды могут транспортироваться и презентироваться на клеточной поверхности. Этот процесс осуществляется специализированными гликопротеидами клетки-хозяина, которые кодируются большой группой генов, носящих название главный комплекс гистосовместимости – MHC (Major histocompability complex).

Локус MHC кодирует два набора высокополиморфных клеточных белков, названных молекулами MHC класса I и класса II. Важнейшей функцией молекул МНС является связывание и презентация патогенных пептидов, а также собственных белков организма рецепторам Т-лимфоцитов. С этой способностью связана другая важнейшая функция МНС – селекция и формирование репертуара Т-клеток, обладающего способностью отличать "свое" от "чужого". [3]

Каждый организм обладает определенным гаплотипом, т.е. набором сцепленных на одной хромосоме генов главного комплекса гистосовместимости. В ответ на трансплантацию тканей, несущих чужеродные молекулы МНС, которые отличаются от молекул реципиента хотя бы на одну аминокислоту, будет наблюдаться пролиферация Т-клеток. Такой ответ назван аллореактивностью, т.е. ответ на аллогенные (чужеродные) молекулы МНС.

Молекулы МНС класса I способны связывать пептиды из 8-9 аминокислотных остатков, молекулы класса II - несколько более длинные. Высокий полиморфизм молекул MHC, а также способность каждой антигенпрезентирующей клетки (APC) экспрессировать несколько разных молекул MHC обеспечивают возможность презентации T-клеткам множества самых различных антигенных пептидов.

Пептиды, связанные с молекулой MHC класса I, распознаются Т-клетками CD8⁺ – цитотоксическими T-клетками (CTL), тогда как пептиды, связанные с MHC класса II, – CD4 Т-клетками воспаления (Тh1) , либо хелперными Т-клетками CD4⁺ (Тh2). Наивные Т-клетки CD8⁺, вышедшие из тимуса, уже предопределены стать цитотоксическими клетками. Тh1 участвуют в активации АПК (макрофагов и дендритных клеток), тогда как Тh2 – в активации В клеток.

Однако, этого взаимодействия недостаточно для пролиферации и дифференцировки наивных Т-клеток в эффекторные Т-лимфоциты. Для увеличения численности антиген-специфичных клонов наивных Т-клеток требуется ко-стимуляторный сигнал от APC, на поверхности которой происходит распознование антигена Т-лимфоцитом. Для T-клеток CD8⁺ требуется более сильный ко-стимуляторный сигнал, чем для клеток CD4⁺, и для их пролиферации часто необходим сигнал от клетки CD4⁺, взаимодействующей с той же APC.[3]

Ко-стимуляторный сигнал от APC осуществляется молекулой B7 – гетеродимером, относящимся к суперсемейству иммуноглобулинов. Молекула B7 находится лишь на поверхности антиген-презентирующих клеток и может стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов. Рецептором для B7 на поверхности Т-клетки, осуществляющим ее активацию, является молекула CD28.[3]

Для активации T-клеток CD8⁺, их пролиферации и генерации эффекторных ЦТЛ помимо образования комплекса MHC/пептид, и ко-стимуляторного сигнала от молекулы В7 и CD28 необходима продукция цитокина IL-2 и связывание IL-2 с его рецептором IL-2Rαβγ на поверхности Т клетки. Однако этих двух сигналов недостаточно для полной активации наивной Т-клетки. Необходим, также третий сигнал, осуществляемый IL-12. IL-12 необходим для оптимальной IL-2 зависимой пролиферации и клональной экспансии. Эксперименты, исследующие стимуляцию наивных T-клеток CD8⁺ in vitro показали, что IL-12 вызывает экспрессию IL-2R α-цепи на значительно более высоком уровне, нежели в ответ только на TCR и ко-стимуляцию и/или IL-2. В дополнение, высокий уровень экспрессии СD25 пролонгировался в присутствии IL-12.[8,10,11,12,13]

Для активации CTL необходим также сигнал от специализированной APC. Активацию APC стимулирует Т-клетка CD4⁺. Такой специализированной APC является дендритная клетка. Связь между дендритной клеткой и Т-хелпером осуществляется с помощью молекул CD40 и CD40L. Молекула CD40L – мембранный белок, экспрессируемый антигенстимулированной CD4⁺Т-клеткой. CD40L связывается с молекулой CD40 на поверхности дендритной клетки, что приводит к ее активации и индуцибельной экспрессии молекул семейства В7. [16]

Результатом активации лимфоцитов может являться их дифференцировка в клетки памяти, которые могут существовать очень длительное время, возможно до 20 лет и более, предположительно не подвергаясь стимуляции антигенами. Они имеют более низкий порог активации, нежели наивные Т-клетки. Ряд поверхностных молекул, вовлеченных в функционирование Т-клеток, экспрессируются на более высоком уровне клетками памяти, нежели другими Т-клетками, что способствует более быстрой активации клеток памяти.[4,5]

Существует два типа TCR. Первым, с помощью моноклональкых антител, был идентифицирован αβ TCR рецептор. Он представляет собой гетеродимер (80-90 кДА), связанный дисульфидными связями, состоящий из α и β цепей (43-49 кДа и 38-44 кДа). αβ TCR экспрессируется большинством периферических Т-лимфоцитов и его структура отвечает за связывание с комплексом молекула МНС-пептид. Вторая форма ТСR – γδ рецептор экспрессируется меньшей популяцией Т-клеток у мышей и человека, в пределах от 1% до 10% всей популяции. Т-клетки несущие такой TCR появляются в раннем онтогенезе. Многие Т-клетки экспрессирующие γδ рецептор не экспрессируют молекулы CD4 или CD8, которые характеризуют зрелые функциональные αβ Т-клетки.

Созревание γδ TCR может происходить как в тимусе, так и вне него. Установлено, что эти клетки способны распознавать самые разнообразные антигены, например N-формилированные бактериальные пептиды и аутоантигены — белки теплового шока – или неклассические антигены МНС класса I, такие как продукты ТL-локуса у мыши или молекулы СD1 у человека.[4]

Анатомическая локализация Т-клеток различается в зависимости от того, какой разновидностью TCR они обладают. Форму αβ несет большинство TCR-экспрессирующих тимоцитов и свыше 95% периферических Т-клеток. Форму γδ, напротив, несут Т-клетки, встречающиеся только в определенных тканях организма: они составляют небольшую долю Т-клеток тимуса и вторичных лимфоидных органов, но при этом значительную часть Т-клеток эпителиальных покровов, например эпидермиса (у мыши, но не у человека), а также эпителия, выстилающего слизистую оболочку кишечника, матки и языка. [1,4]

Обе цепи αβ TCR рецептора имеют два внутриклеточных домена, один вариабельный и другой константный. Вариабельные домены α и β цепей вместе формируют антиген-связывающий сайт Т-клеточного рецептора. Вариабельные домены представляют собой β-складки близкие по своей структуре к вариабельным доменам иммуноглобулинов. [4]

Рецептор, экспрессируемый каждым лимфоцитом, обладает специфичностью к разнообразным антигенам, которая определена структурой антиген-связывающего сайта. Широкое разнообразие специфичностей в репертуаре антиген-специфических рецепторов осуществляется за счет вариаций аминокислотных последовательностей в антиген-связывающем сайте, который образован V-районом белковой цепи рецептора. V-район цепи рецептора кодируется несколькими участками – генными сегментами. Механизм сборки завершенной последовательности V-района в результате соматической рекомбинации ДНК получил название генной реаранжировки. Каждый генный сегмент представлен в нативном геноме множеством копий. Реаранжировка происходит случайным образом, что приводит к формированию большого разнообразия TCR. [3,4]

Каждый вариабельный домен кодируют гены, образованные в результате рекомбинации V- (variable), D- (diversity), и J- (joining) сегментов в случае β- цепей, и V- и J-сегментов, в случае α-цепей. В аминокислотной последовательности V-доменов TCR обнаружены области повышенной вариабельности, которые соответствуют гипервариабельным участкам цепей Ig известным также как участки определяющие комплементарность (СDRs, от complementory-determining regions). [3]

Самые начальные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов осуществляются в костном мозге, когда из стволовой кроветворной клетки образуется наиболее ранний предшественник, мигрирующий в тимус. Это двойной негативный предшественник (DN), не экспрессирующий на своей поверхности TCR и корецепторы CD4 и CD8.

В процессе дифференцировки DN клеток можно выделить 4 последовательных стадии по экспрессии поверхностных клеточных маркеров CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты) и CD25 (α-цепь интерлейкинового (IL)-2 рецептора): DN1, CD44⁺CD25^-; DN2, CD44⁺CD25⁺; DN3, CD44^-CD25⁺; DN4, CD44^-CD25^-.[3]

Схема 1. Этапы развития Т лимфоцитов

На стадии DN1 гены, кодирующие обе цепи TCR находятся в нативной конфигурации. На стадии DN2 начинается реаранжировка β-цепи Т-клеточного рецептора. V(D)J реаранжировка осуществляется посредством белков RAG-1 и RAG-2, которые осуществляют разрывы в двуцепочечной молекуле ДНК между V, D и J сегментами и их сигнальными последовательностями (RSS).[14] Сначала короткий D сегмент реаранжируется с J сегментом, затем следует присоединение V сегмента к реаранжированному DJ сегменту, после чего к новообразованному V району присоединяется один из двух экзонов константного (С) района.[3,15]

Контроль реаранжировки осуществляется посредством сохранения некодирующих последовательностей ДНК, которые располагается там, где происходит реаранжировка. Эти последовательности представляют собой постоянные группы состоящие из 7 нуклеотидов – гептамеры 5´CACAGTG3´ – которые всегда присоединены к кодирующей последовательности, за которой следует спейсер, состоящий из 12 или 23 нуклеотидов. Затем следует вторая постоянная группа, состоящая из 9 нуклеотидов – нонамер 5´ACAAAAACC3´. Последовательность нуклеотидов в спейсере может изменяться, но длина остается постоянной. Последовательность гептамер-спейсер-нонамер названа recombination signal sequence (RSS).[3]

Реаранжировка может происходить только между генами, локализованными на одной хромосоме. Таким образом генный сегмент, фланкированный RSS со спейсером из 12 нуклеотидов, может присоединяться к фланкированному RSS спейсеру из 23 нуклеотидов. V-сегменты фланкированы 3´спейсером из 23 нуклеотидов, J – 5´спейсером из 12 нуклеотидов, а D-сегменты фланкированы как 5´спейсером из 12 нуклеотидов, так и 3´спейсером из 23 нуклеотидов.[14]

Существенный вклад в разнообразие ТCR вносят так называемые N(non-template-encoded) и P(polindromic) нуклеотиды, которые могут добавляться либо удаляться случайным образом в ходе реаранжировки в местах контактов V, D и J сегментов. Этот процесс осуществляет фермент-терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT).[3]

Для β-цепи действует правило аллельного исключения, в силу которого реаранжировке может подвергаться только один из двух аллелей β-цепи TCR. Это позволяет исключить возможность экспрессии двух различных β-цепей TCR на одной клетке. Этот процесс также контролируется белками RAG1 и RAG2.

В клетках, экспрессирующих αβ TCR на, стадии DN3 впервые начинается экспрессия пре-TCR, состоящего из β цепи и суррогатной пре-TCR-α цепи, кодируемой нереаранжированным локусом. На поверхности клетки пре-TCR-αβ ассоциирован с комплексом CD3.[7,9]

Локус α-цепи TCR не содержит D сегментов. Реаранжировка генов происходит в результате соматических рекомбинаций V и J сегментов.

Тимоциты также начинают экспрессировать поверхностные ко-рецепторы CD8 и CD4. Это двойные позитивные клетки (DP; CD4⁺CD8⁺), экспрессирующие αβ-TCR, они составляют до 90% от всех клеток в тимусе.

На стадии DP вновь начинается экспрссия RAG генов и происходит реаранжировка Vα и Jα сегментов. Продукция новой TCRα цепи, которая может образовывать пару с TCRβ цепью, позволяет происходить экспрессии комплекса TCR-αβ и CD3 на клеточной поверхности.

Для окончательного созревания DP клетки подвергаются позитивной и негативной селекции, в результате которой лишь 5% клеток из всего репертуара DP тимоцитов эмигрируют на периферию.

Дальнейшая судьба клеток CD4⁺CD8⁺ зависит от взаимодействия TCR с молекулами МНС. [7,9]

В 1996 году группой ученых было установлено, что способность Т-клеточных рецепторов к взаимодействию с молекулами МНС не формируется в процессе тимусной селекции, как полагали ранее, а присутствует в репертуаре исходно. Иными словами аллореактивность является врожденным свойством репертуара Т-клеток. Стимулируя развитие Т-клеток искусственно антителами к молекулам TCR αβ и CD4 в органных культурах фетального тимуса мыши с дефектными генами МНС, было показано, что в селектированном репертуаре с высокой частотой встречаются клетки, способные к взаимодействию с различными аллельными формами молекул МНС, хотя в процессе своего развития Т-клетки такого репертуара не имели возможости "увидеть" какую-либо из них и, следовательно, "научиться" их распознавать. Количество таких клеток было сопоставимо с количеством аллореактивных клеток в репертуаре нормальных мышей, что позволило авторам заключить, что способность к взаимодействию с продуктами МНС присутствует в репертуаре Т-клеток исходно, до прохождения позитивной и негативной селекции в тимусе.[10]