Глава 19

ФЕРМЕНТЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

19.1. Ферменты микробиологического синтеза (ферменты, синтезируемые микроорганизмами)

Получение ферментов из культур микроорганиз­мов является перспективным ввиду неограниченной доступности исходного сырья — бактерий, грибов и актиномицетов. Большие возможности открываются при отборе и искусственном мутагенезе продуцентов для направленного биосинтеза определенных фермен­тов. Биосинтетические методы отличаются высокой производительностью за счет способности микроорга­низмов к интенсивному размножению. Известны бак-

476

терии, которые делятся каждые 30—60 мин, в резуль­тате чего происходит быстрое накопление целевых продуктов в биомассе или культуральной среде. По­этому, несмотря на ряд лимитирующих факторов, ме­тоды биотехнологии являются экономически более эффективными, чем методы получения биологически активных веществ из дорогого и дефицитного живот­ного сырья.

^Биотехнологический процесс включает большую подготовительную работу: очистку и стерилизацию воздуха, посуды и аппаратов; подготовку питатель­ной среды для биосинтеза и ее стерилизацию; выра­щивание посевного материала исходной культуры. Засев производственной питательной среды и выра­щивание микроорганизмов (продуцентов ферментов) проводят в ферментаторе. Культивирование микро­организмов осуществляют в основном глубинным спо­собом в жидкой питательной среде при строго опре­деленном значении рН, времени и температуры, по­давая стерильный воздух.

Большинство ферментов промышленного производ­ства относится к внеклеточным, поэтому накаплива­ются в культуральной жидкости, что значительно упрощает их выделение (схема 19.1). Культуральную жидкость отделяют от частиц мицелия фильтрова­нием через синтетические ткани, применяемые в пи­щевой промышленности и обладающие механической и химической прочностью. С целью улучшения про­цесса фильтрации используют дополнительный филь­трующий слой из материалов, имеющих высокие гид­родинамические свойства — перлит, уголь активиро­ванный и др. Для повышения качества фильтрата по цветности и прозрачности применяют соосажде-ние мелкодисперсных взвешенных частиц мицелия и высаливание балластных веществ аммония сульфа­том. Осветление растворов проводят микрофильтра­цией через мембраны с диаметром пор от 0,45 до 0.8 мкм. Снижение микробной контаминации осуще­ствляют стерильной фильтрацией через мембраны с диаметром пор от 0,1 до 0,3 мкм.

При выделении изоферментов (внутриклеточных) основной задачей является сбор клеток, содержащих фермент, с последующей их промывкой буферным раствором. Наилучшие результаты отделения клеток обеспечивает микрофильтрация через мембранные

477

-СХЕМА 19.1. Технология ферментов, получаемых биотехнологи­ческими методами

Нультивирование микроорганизма— продуцента фермента

Отделение биомассы (центрифугирование, сепарирование, фильтрование)

\			\
Разрушение клеток микро­организмов (дезинтеграция, ферментативный или химический лизис)			Нонцентрирование (ультра­фильтрация, ионнообменная хроматография и т.д.)
	\
Экстракция белков
■
Отделение экстракта от разрушенных клеток продуцента (центрифугиро­вание, сепарирование, мембранная фильтрация)
			Очистка целевого продукта с помощью различных методов
			(в том числе хроматогра-фических)

Приготовление лекарственных форм

t—внутриклеточные ферменты 2~в«ендеточные ферменты

фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Осуществляют ее в тангенциальном потоке, при котором фильтруе­мая жидкость подается под небольшим углом к по­верхности мембраны, чтц позволяет постоянно смы­вать слой частиц, образующихся на ее поверхности. Его удаление происходит также за.счет высокой ско-

478

- - рости подачи исходного раствора в фильтрующую -систему. Таким путем удается переработать большие 'объемы растворов и получить высококоицентриро­ванные суспензии.

Следующей стадией выделения внутриклеточных ферментов (например, аспарагиназы, пенициллиназы) является разрушение клеток путем механической, гидродинамической или ультразвуковой дезинтеграции или лизиса с помощью ферментов и другими спосо­бами. Очищают растворы микрофильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм. Так как целевым компонентом является фильтрат, то на­ряду с фильтрацией в тангенциальном потоке исполь­зуют и обычную — через патронные фильтры. Из рас­творов ферменты выделяют фракционированием ней­тральными солями и растворителями, а также изо-электрическим осаждением.

Одним из прогрессивных методов очистки являет­ся ультрафильтрация, позволяющая проводить раз­деление в соответствии с размером молекул или моле­кулярной массой веществ. Основной характеристикой .. ультрафильтрационной мембраны является * средний предел полного деления частиц глобулярного белка, которые не проходят через мембрану. Наличие ши­рокого набора мембран с пределами отсечения от 1 тыс. до i млн дальтон (обычно 1, 10, 30 тыс. и 1 млн) по­зволяет отделять различные примеси, очищать, кон­центрировать и обессоливать целевой продукт. Уль­трафильтрация осуществляется в тангенциальном ■*.. ийтоке, обессоливание или удаление иизкомолекуляр-ных примесей (м.м. ниже предела деления мембра­ны) — в режиме диафильтрацин, т. е. при постоян­ном объеме фильтруемой жидкости, за счет воспол­нения фильтрата равным объемом воды или буфер­ного раствора.

Важную роль в технологии выделения и очистки ферментов играют хроматографические методы. Они включают гель-фильтрацию или эксклюзионную хро­матографию, когда время выхода вещества из хро-матографической колонки зависит от размера его мо­лекул или молекулярной массы (более крупные моле­кулы не входят в поры сорбента и элюируются рань-^ше); .ионообменную хроматографию, разделение при которой основано на различиях в суммарных зарядах Рисутствующих веществ при данном значении рН

479

(вещества, имеющие большой заряд, удерживаются сильнее и элюируются позже); обращенно-фазовую или гидрофобную хроматографию, при которой гидро­фобные вещества сильнее связываются с поверхностью сорбента и элюируются позже. При очистке фермен­тов используют один или несколько из указанных методов хроматографического разделения.

Перспективной для выделения и очистки фермен­тов является аффинная хроматография, разделение с помощью которой основано на том, что один из ком­понентов смеси обладает повышенной способностью к связыванию с лигандом, присоединенным ковалент-ной связью к инертному носителю. При пропускании смеси белков или культуральной жидкости через ко­лонку, заполненную таким сорбентом, молекулы со­единения, обладающие сродством к лиганду, удержи­ваются в колонке, в то время как другие выходят из нее. Вещество из колонки селективно элюируют с по­мощью буфера, содержащего лиганд или его аналог, иногда с добавлением какого-либо растворителя.

Препараты ферментов микробиологического синте­за. Террилитин (Terrilytinum) —препарат содер­жит очищенный протеолитический фермент, получае­мый из культуры плесневого гриба Aspergillus terri-cola. Он первый лекарственный микробный фермент, освоенный в 1976 г. отечественной промышленностью по разработкам Всесоюзного научно-исследователь­ского технологического института антибиотиков и фер­ментов медицинского назначения (ВНИТИАФ). По­добно большинству белковых препаратов микробного происхождения является комплексным препаратом, представленным тремя протеазами, из которых основ­ное содержание, около 90%, составляет протеаза-1. Молекулярная масса террилитина 26 800, область стабильности при значении рН 4,0—9,0.

Террилитин представляет собой лиофилизирован-ный порошок или пористую массу белого цвета, лег­ко растворим в воде, значение рН 1 % водного рас­твора 4,8—6,5; активность, выраженная в протеоли-тических единицах (ПЕ), должна быть не менее 2 в 1 мг. Препарат выпускают в герметически укупорен­ных флаконах по 200 ПЕ, хранят по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, при температуре не вы­ше 4 °С. Применяют наружно и в виде ингаляций для расщепления гнойных экссудатов, некротических тка-480

1Р*ней, при лечении гнойных ран, ожогов, заболеваний верхних дыхательных путей.

О раз a (Orazum) —содержит комплекс амило-литических (амилазы, мальтазы) и протеолитических ферментов, получаемых из культуры гриба Aspergil­lus oryzae. Препарат представляет собой аморфный порошок от светло-желтого до темно-желтого цвета, растворимый в воде, устойчив в интервале значений рН 2,5—9,0. Для медицинских целей его получают из технического продукта амилоризина-ПХ, высушенной и измельченной поверхностной культуры плесневого гриба Aspergillus oryzae, извлеченной водной экстрак­цией с последующей фракционной очисткой органи­ческими растворителями. Выпускают препарат в фор­ме гранул по 100 г в стеклянных банках. Хранят в сухом, прохладном месте. Применяют при расстрой­ствах пищеварения, протекающих с угнетением функ­ции пищеварительных желез.

Солизим (Solizymum) —ферментный препарат липолитического действия, полученный из культуры гриба Penicillium solitum. Он представляет собой гиг­роскопический порошок светло-коричневого цвета со •слабым специфическим запахом, мало растворимый в воде и практически нерастворимый в этаноле, хло­роформе, эфире. Область стабильности при значении рН 6,5—9,5. Активность препарата определяют по способности гидролизовать эмульсию масла оливко­вого и выражают в ЛЕ (липолитических единицах). Солизим выпускают в таблетках с содержанием 20000 ЛЕ. Таблетки получают гранулированием со-лизима и сахара 5% раствором ПВП в хлороформе в установке с псевдоожижением вещества, сушат при температуре не выше 40 °С, покрывают оболочкой из ацетилфталилцеллюлозы в спирто-ацетоновом раство­ре с добавлением красящих веществ. Благодаря обо­лочке таблетки выделяют фермент лишь в верхних отделах кишечника. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 4 °С. Приме­няют при хронических заболеваниях желудочно-ки­шечного тракта и панкреатитах.

Стрептолиаза (Streptoliasum) —препарат, со­держащий фермент стрептокиназу, получаемый из культуры р-гемолитического стрептококка группы С. иофиллизированный препарат представляет собой пористую массу белого цвета, легко растворимую в

481

воде. Активность стрептолиазы выражают в ЕД, За ЕД принимают количество, лизирующее в определен­ных условиях сгусток фибрина, образованный смесью растворов фибриногена и тромбина. Выпускают в ам­пулах по 250 000 и 500 000 ЕД. Хранят при темпера­туре от 4 до 10 °С. Применяют в качестве фибрино-литического (тромболитического) средства. Недостат­ком является малая стабильность в организме: период полураспада стрептокиназы составляет 20—80 мин, ввиду чего препарат вводят внутривенно (в необхо­димых случаях — внутриартериально) капельно на протяжении 16—18 ч. Высокая иммунная активность является причиной побочных эффектов (озноб, лихо­радка, аллергические реакции). Препарат стрептоки­назы, лишенный указанных недостатков, получен ее иммобилизацией на водорастворимой полисахаридной матрице (см. стрептодеказу).

Аспарагиназа (Asparaginasum) — L-acna-рагиназа (L-аспарагин-амииогидролаза) — фермент, расщепляющий аспарагин на кислоту аспарагиновую и аммиак. Продуцируется разными штаммами кишеч­ной палочки (Escherichia coli). Технология паренте­рального препарата L-аспарагиназы из Е.coli разра­ботана совместными исследованиями Института орга­нического синтеза (ИОС) АН Латвийской ССР и ВНИИ антибиотиков. Он представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и изо­тоническом растворе натрия хлорида. В качестве стабилизатора содержит глицин. Активность выража­ется в международных единицах действия (ME). За ME принято количество фермента, освобождающее 1 мкмоль аммиака из аспарагина за 1 мин. Препарат выпускают в •лиофилизированном виде' во флаконах, содержащих по 3000 и 10 000 ME L-аспарагиназы для инъекций. Хранят по списку Б, при температуре не выше 10 °С. Применяют при лечении острой лимфо-бластической лейкемии. Действие основано на том, что некоторые опухоли и лейкемические клетки не синтезируют аспарагин и поэтому нуждаются в его поступлении извне, например с пищей. Введение L-аспарагиназы позволяет искусственно ограничить поступление в опухоли указанной аминокислоты и по­давляет их рост.

П е н и ц и л л и н а з a (Penicillinasum) — фер­мент, продуцируемый Bacillus lecheniformis штамм 482

749/с. Представляет собой белый аморфный гигро­скопический порошок, легко растворимый в воде. Активность препарата выражается в ЕД. За ЕД принимают его наименьшее количество, способное инактивировать 10~⁷ моля (около 60 ЕД) бензил-пенициллина в 1 мл фосфатного буфера в течение 1 ч при температуре 37 °С. Препарат выпускают в герметически укупоренных флаконах или ампулах по 500 000 и 1 000 000 ЕД. Хранят при комнатной температуре. Применяют при острых аллергических реакциях и анафилактическом шоке, вызванных препаратами группы пенициллина.