18.3. Препараты ферментов

Ферменты — биологические катализаторы белковой природы, содержащиеся во всех клетках живых ор­ганизмов. Они катализируют биохимические реакции, которые без них протекали бы с неизмеримо малой скоростью.

Важнейшими свойствами ферментов являются эф­фективность катализа (позволяют увеличивать ско­рость реакций в 10¹⁰—10¹² раз) и исключительная избирательность действия (каждый фермент катали­зирует, как правило, одну химическую реакцию). Как и нее белки, ферменты являются высокомолекуляр-

465

ными соединениями, с молекулярной массой от 10000 до 1000 000. Ферментные белки, обладая малостойкой структурой, весьма чувствительны к изменениям зна­чения рН и температуры. Для каждого фермента существует оптимум значения рН, при котором ско­рость катализируемой реакции максимальна. Так, активность трипсина имеет оптимум при значении рН 7,8; панкреатической амилазы — при 6,4—7,2. Отклонение значения рН в ту или иную сторону ведет к снижению скорости ферментативной реакции. Фер­менты, оптимальное действие которых находится в нейтральной или щелочной средах, полностью ииакти-вируются кислым содержимым желудка.

Оптимальное значение температуры для большин­ства ферментов — 20—40 °С. Повышение температуры до 40—50 °С, как правило, приводит к падению фер­ментативной активности, а иногда и к полной дена­турации ферментов.

При производстве энзимных препаратов наряду с применением высокоэффективных научно обоснован­ных способов получения особенно необходима высо­кая культура производства, строгое соблюдение ре­жимов технологии. Большое внимание уделяется ста­билизации ферментов как на стадии получения суб­станции, так и в лекарственной форме. В настоящее время используют три основных приема стабилиза­ции: защита лабильных центров ферментов, ответ­ственных за их активность, химической модификацией (в том числе иммобилизацией); защита от воздейст­вия инактивирующих факторов нанесением оболочки и введением в субстанцию или лекарственную форму добавок, ингибирующих деструкцию ферментов.

Источником получения ферментов являются органы и ткани животных, растительное сырье и ферменты, продуцируемые микроорганизмами. Основное количе­ство ферментных препаратов медицинского назначе­ния получают из органов и тканей животных. Из фер­ментов растительного происхождения в нашей стране для медицинских целей предложен к использованию только один препарат: липаза из семян чернушки дамасской (Nigella Damascena L.). Вес шире исполь­зуются в медицинской практике ферменты, получае­мые из культур микроорганизмов, преимуществом ко­торых являются более высокая доступность и эконо­мичность их производства.

466

Препараты ферментов слизистой оболочки желуд­ка.-Пепсин (Pepsinum) — препарат, содержащий протеолитический фермент. Сырьем для получения пепсина служит слизистая оболочка желудка свиней, где он образуется в виде профермента — пепсиноге-на. Пепсиноген активируется кислотой хлороводород­ной и аутокаталитически, т. е. с помощью образовав­шихся молекул пепсина. При этом от пепсиногена (м.м. 40 000) сначала отщепляется остаточный поли­пептид, а затем ингибитор пепсина. Образуется актив­ный пепсин (м.м. 34 000). Пепсин относится к карбо-протеиназам, содержащим остатки аминокислот ди-карбоновых в активном центре, с оптимумом значе­ния рН 1,5—2,5.

При выделении протеолитического фермента основ-■ ной задачей является получение (с высоким выходом) его в активной форме. Поэтому экстракцию сочетают •с автолизом. Измельченные ткани заливают водой, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 1,9—2,3. Соотношение сырья и экстрагента 10:1. Настаивание проводят при температуре около 40 °С, перемешивая на протяжении 8 ч и повторно в тече­ние 24 ч. Лизаты сливают, отделяют от верхнего слоя жира, объединяют, процеживают. Ферментную массу выделяют высаливанием, для чего к лизату (значение рН 1,9—2,3) при непрерывном перемешивании добав­ляют 20—25% раствор натрия хлорида. Пепсин, вы­делившийся из раствора, всплывает на поверхность. Его отделяют, сушат в вакуум-сушильном шкафу при

■ температуре 35—40 °С, измельчают в фарфоровой шаровой мельнице и просеивают.

Стандартизуют препарат по протеолитической ак­тивности (переваривание белка куриного яйца): 10 г • протертого белка в присутствии ОД г препарата ; в

■ Стандартных условиях должны полностью растворить­ ся через 3—4 ч, образуя опалесцирующий раствор.

- После определения биологической активности препа­рат смешивают с сахарной пудрой. Он представляет Собой слегка желтоватый порошок, сладкого вкуса со слабым своеобразным запахом. Хранят в хорошо уку­поренных банках в прохладном (2—15°С), защищен­ном от света месте. Применяют при расстройствах . пищеварения (гипо- и анацидный гастрит, ахилия, диспепсия). Назначают внутрь в виде раствора в ком­бинации с ацидином (бетаина гидрохлорид).

467

Ацидин-пепсин (Acidin-pepsinum) выпускают в таблетках по 0,5 и 0,25 г, содержащих 1 часть пеп­сина и 4 части бетаина гидрохлорида. При введении в желудок бетаина гидрохлорид легко гидролизуется с выделением свободной кислоты хлороводородной.

Абомин (Abominum) —препарат, содержащий сумму протеолитических ферментов, получают из сли­зистой оболочки желудка телят и ягнят молочного возраста. Он представляет собой аморфный порошок со специфическим запахом, соленого вкуса (содержит примесь натрия хлорида). Выпускают в форме таб­леток по 0,2 г, с содержанием в 1 таблетке 50 000 ЕД.

Сок желудочный натуральный (Succus gastricus naturalis) получают по методу, предложен­ному И. П. Павловым, через фистулу желудка при мнимом кормлении собак или других животных (ло­шадей). Препарат представляет собой прозрачную бесцветную жидкость кислого вкуса, консервирован­ную кислотой салициловой (0,03—0,04%). Он содер­жит все ферменты желудочного сока, 0,45—0,51 % свободной кислоты хлороводородной, значение рН 0,8—1,2. Выпускают во флаконах по 100 мл. Хранят в защищенном от света месте, при температуре от 2 до 10 °С. Применяют при недостаточной функции желез желудка.

Препарат ферментов поджелудочной железы. Панкреатин (Pancreatinum) —препарат содер­жит ферменты поджелудочной железы, главным об­разом трипсин и амилазу и в незначительном количе­стве липазу. Сырьем для получения панкреатина слу­жит поджелудочная железа свиней или рогатого скота.

В поджелудочной железе протеолитические фер­менты образуются в виде проферментов: трипсино-гена, химотрипсиногена. Активирование этих фермен­тов происходит гидролизом того фрагмента их поли­пептидной цепи, который маскирует активный центр протеиназ. При получении панкреатина активирова­ние проферментов поджелудочной железы осуществ­ляют в экстракте в щелочной среде, в присутствии ионов кальция и с затравкой (панкреатин).

Ткани поджелудочной железы убойных животных измельчают на волчках и заливают водой, подкис­ленной кислотой уксусной — ледяной 5 мл на 1 л во­ды. Настаивание проводят в реакторе с мешалкой в течение 4 ч при температуре 10°С. Экстракт отделя-

468

ют центрифугированием или процеживанием с после­дующим прессованием остатка. Для активирования проферментов в экстракте создают среду со значени­ем рН 8,1; добавляют кальция хлорид, чтобы приго­товить 0,05 М раствор, и затравку — панкреатин. Настаивают 24 ч при температуре 5 °С. Затем экст­ракт подкисляют до значения рН 6,0, и в изоэлектри-ческой точке осаждают балластные белки. Осадок отделяют, обезжиривают ацетоном и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. Измельчают в фарфоровой мельнице.

Стандартизуют панкреатин по протеолитической активности — способности переваривать белок казеин в слабощелочной среде. Панкреатин должен содер­жать в 1 г 25—33 ЕД. Препарат выпускают в порош­ке и таблетках, покрытых оболочками, растворимыми в кишечнике. Хранят в хорошо закупоренных банках, в сухом, прохладном месте. Применяют при хрониче­ских панкреатитах с недостаточной функцией подже­лудочной железы.

Технология ферментных препаратов из поджелу­дочной железы крупного рогатого скота: дезоксири-бонуклеазы (ДНКаза), рибонуклеазы (РНКаза), трипсина, химотрипсина, ингибитора протеаз — пан-трипина и инсулина — разработана лабораторией орга­нопрепаратов Всесоюзного научно-исследовательского института мясной промышленности. Принцип произ­водства заключается в том, что измельченную под­желудочную железу подвергают автолизу, для чего смешивают ее с половинным количеством воды и ос­тавляют на 18 ч при температуре 12 °С. Затем в реак­торе с мешалкой проводят экстракцию методом бис-мацерации водой, подкисленной кислотой ортофос-форной до значения рН 2,0—2,5, при температуре не выше 5°С. Первая мацерация проводится с двойным количеством воды в течение 16 ч, вторая — с одно­кратным 1 ч. Экстракты отделяют от жмыха центри­фугированием и объединяют. Жмых используют для получения инсулина, а из экстракта высаливают фер­менты различными концентрациями аммония суль­фата (ДНКазу и РНКазу), добавляя кристалличе­ский аммония сульфат до определенной степени насы­щения при перемешивании и охлаждении. Фильтрат используют для получения химотрипсина, трипсина и пантрипина.

469

Высол растворяют в воде (1:4) ив водном рас­творе осаждают балластные вещества добавлением аммония сульфата. Осадок отбрасывают, а к филь­трату добавляют 5 н. раствор натрия гидроксида до значения рН 4,5 и высаливают ДНКазу, медленно добавляя насыщенный раствор аммония сульфата до степени насыщения 0,4. Осадок ДНКазы отделяют и подвергают дальнейшей очистке. Из фильтрата осаж­дают РНКазу высаливанием аммония сульфатом до степени насыщения 0,8. Высол, содержащий аморф­ную РНКазу, отстаивают при 4—5 °С в течение 40— 48 ч, жидкость сифонируют, а осадок отделяют на нутч-фильтре или центрифугированием. Полученную РНКазу очищают. Из фильтрата, содержащего комп­лекс ферментов, аммония сульфатом при степени на­сыщения 0,7 высаливают химотрипсин, трипсин и пан-трипин.

Из смеси ферментов получают неактивный химо-трипсиноген. Для этого осадок растворяют в воде, подкисленной кислотой серной до значения рН 3,0, при температуре не выше 5 °С и медленно добавляют при перемешивании раствор аммония сульфата. Затем раствор подщелачивают 5 н. раствором натрия гидро­ксида до значения рН 5,0 и выдерживают при ком­натной температуре до полного осаждения кристал­лического химотрипсиногена.

Из фильтрата и промывных вод, полученных после отделения химотрипсиногена, выделяют трипсиноген высаливанием аммония сульфатом при подкислении 5 н. кислотой серной до значения рН 3,0.

Фильтрат, оставшийся после выделения трипсина, подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 2,5 при температуре 5 °С. Из подкисленного филь­трата добавлением кристаллического магния суль­фата высаливают пантрипин совместно с балластны­ми белками. Последние удаляют коагуляцией при на­гревании раствора до температуры 90 °С в течение 1 мин и быстром охлаждении до температуры 20— 25 °С. Осадок балластных веществ отделяют фильтро­ванием. К фильтрату, объединенному с промывными водами, медленно при перемешивании добавляют крис­таллический аммония сульфат и отстаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. В результате обра­зуется два осадка; аморфный и кристаллический. Тем-

470

ный аморфный осадок пантрипина отделяют от бело­го кристаллического осадка балластных веществ. Оса­док пантрипина растворяют в воде и диализируют. По окончании диализа раствор фильтруют, стандар­тизуют по сухому остатку и силе ингибирующего дей­ствия пантрипина. Проводят стерилизующую филь­трацию, разливают во флаконы и подвергают субли­мационной сушке.

Очистка индивидуальных ферментов продолжает-ся несколько дней и состоит из ряда многократно по­вторяющихся операций.

Проводят 3-кратное высаливание ферментов ам-. мония сульфатом до различной степени насыщения, изменяя значения рН. Каждый раз из фильтрата пред­варительно удаляют балластные вещества осажде-нием аммония сульфатом меньшей концентрации, чем применяемая при высаливании ферментов, затем осу­ществляют 5-кратную перекристаллизацию ферментов. Химотрипсиноген и трипсиноген активируют до обра-

- зования химотрипсина и трипсина в соответствующих буферных растворах при пониженной температуре при добавлении кристаллика трипсина. Обессоливают ферменты диализом через целлофановую пленку. Суль­ фат-ионы осаждают бария хлоридом, а избыток иона бария удаляют на катионите КУ-2. В обессоленных растворах ферментов устанавливают необходимое значение рН, определяют концентрацию сухого ве-

- щества и разбавляют водой дистиллированной в соот­ ветствии с конечным содержанием сухого препарата во флаконах. Разбавленные растворы фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке.

Дезоксирибонуклеаза (Desoxyribonucle-

■ asa) представляет собой лиофилизированный белый

.- норошок, легко„ растворимый в воде; значение

• рН 0,1%~ водного раствора составляет 3,0—5,5. В вод-

• ных растворах фермент нестоек (срок годности 12 ч), термолабилен, инактивируется при температуре 55 °С.

• Активность определяют по образованию кислоторас-

творимых продуктов, освобождаемых препаратом из

•ДНК; в определенных условиях, и выражают в еди-

■- вицах активности (-ЕА).-В 1 мг препарата должно

■ содержаться не менее 1700 ЕА. Выпускают в герме-

- тически укупоренных флаконах по 5, 10, 25 и 50 мг.

471

Хранят в сухом, защищенном от света месте, при тем­пературе не выше 20 °С. Применяется как средство, вызывающее деполимеризацию и разжижение гноя и задерживающее развитие вирусов, содержащих ДНК (герпеса, аденовирусов и др.). Назначают в ви­де аэрозолей для ингаляций.

Рибонуклеаза аморфная (Ribonucleasum amorphum) —лиофилизированный порошок белого цвета, растворимый в воде. Активность определяют биологическим методом по количеству кислоторас-творимых веществ, освобождаемых препаратом в ре­зультате гидролиза кислоты рибонуклеиновой в опре­деленных условиях. 1 ЕА соответствует 1 мг препа­рата. Выпускают в герметически укупоренных фла­конах по 10, 25, 50 мг. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше 15 °С. При­меняют местно в виде аэрозолей для ингаляций, внут-риплеврально, внутримышечно при заболеваниях, со­провождающихся гнойно-некротическими процессами.

Химотрипсин кристаллический (Chy-motrypsinum crystallisatum) представляет собой блес­тящие чешуйки или порошок белого цвета, легко рас­творимый в воде, значение рН 0,2 % водного раство­ра составляет 4,5—6,5. Водные растворы быстро инак-тивируются. Выпускают в герметически укупоренных флаконах, содержащих по 5 и 10 мг кристаллического химотрипсина. Хранят в прохладном (не выше 10 °С), защищенном от света месте. Применяют как рибо-нуклеазу.

Трипсин кристаллический (Trypsinum crystallisatum) представляет собой пористую массу или порошок белого цвета, легко растворимый в воде, значение рН 0,2 % водного раствора составляет 3,0— 3,5. В нейтральных и щелочных растворах препарат быстро разрушается. Выпускают в герметически уку­поренных флаконах или в ампулах по 5 и 10 мг. Хра­нят в сухом, защищенном от света месте, при темпе­ратуре не выше 10 °С. Применяют как химотрипсин.

Пантрипин (Pantrypinum) —ингибитор про-теаз (трипсина, химотрипсина и др.), представляет собой лиофилизированный порошок желтоватого цве­та, хорошо растворимый в воде. Стандартизуют био­логическим путем по способности понижать актив­ность трипсина. В 1 г препарата содержится не ме-

нее 650 ЕД. Выпускают в герметически укупоренных флаконах по 6, 12, 15, 20 и 30 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не вы­ше 20 °С. Применяют при панкреатитах, вводят внут­ривенно.

Препараты ферментов из семенников. Ронида-за (Ronidasum) —препарат, содержащий фермент гиалуронидазу, получают из семенников половозрело­го крупного рогатого скота. Семенники обрабатывают 2% раствором фенола в течение 5—15 мин, тщатель­но промывают водой, снимают оболочку и измельчают на волчке. Измельченные семенники заливают физио­логическим раствором, содержащим 0,25 % хлоро­форма в соотношении 1,0:0,5, и экстрагируют ро-нидазу при перемешивании в течение 35—40 мин. Экстракт отделяют фильтрованием, осадок отжимают под гидравлическим прессом, отжатую жидкость при­соединяют к экстракту, разливают по кассетам из нер­жавеющей стали, сушат методом сублимации. Высу­шенный препарат измельчают в шаровой мельнице, расфасовывают в стеклянные флаконы по 5 и 10 г, герметически укупоривают. Хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре. Применяют наружно при лечении рубцов (ожоговых, послеопе­рационных), контрактур суставов.

Лидаза (Lydasum) —препарат гиалуронидазо-вого действия. Для получения лидазы измельченные семенники крупного рогатого скота обрабатывают 0,1 н. раствором кислоты уксусной в отношении 1 : 2 при температуре 10 °С и перемешивании в течение 4 ч. Надосадочную жидкость отделяют и ацетоном осаждают фермент гиалуронидазу. Осадок растворя­ют в воде и процесс осаждения ацетоном повторяют три раза. Освобожденный от ацетона осадок очищен­ной гиалуронидазы растворяют в воде, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и высушивают методом сублимации. Выпускают во флаконах, содержащих по 64 УЕ (условные единицы) стерильного сухого вещества. Хранят в сухом, тем­ном месте, при температуре не выше 15 °С. Основными показаниями к применению лидазы являются контр­актуры суставов, рубцы после ожогов и операций, анкилозирующий спондилоартрит, гематомы и др. Раствор вводят под кожу.

472

473

18.4. ПРЕПАРАТЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

ПаНТОКр'-¹" (Pantnfrinnm) — ЖИДКИЙ СПИрТОВОЙ

экстракт из неокостенелых рогов (пантов) марала, пятнистого оленя, изюбра. Сухие панты обрабатывают паром, очищают от кожи и шерсти, распиливают на дисковой пиле на пластинки толщиной 3—4 мм, из­мельчают на дезинтеграторе. Измельченные панты экстрагируют 50 % этанолом, подкисленным кислотой уксусной до значения рН 5,6—5,8, методом 4-крат­ной мацерации при периодическом помешивании. После каждой мацерации, продолжающейся 3 сут, экстракционную смесь фильтруют для отделения твер­дой фазы от извлечения. Спиртовой экстракт очища­ют от белков отстаиванием при температуре 4—8 °С в течение 5—7 суток с последующим фильтрованием.

Стандартизуют по сухому остатку, которого в пре­парате должно быть 0,65—0,85 %; значение рН экс­тракта устанавливают (применяя кислоту уксусную, или натрия гидроксид) в пределах 5,4—5,8; содержа­ние этанола должно составлять 48—52 %. Пантокрин выпускают во флаконах по 50 мл (капли для внутри­венного применения) и ампулах по 1 и 2 мл (для под­кожного или внутримышечного введения). Сохраня­ют в прохладном, защищенном от света месте. При­меняют в качестве тонизирующего средства при пере­утомлении, гипотонии, неврозах.

Рантарин (Rantarinum) — этанольный экстракт из пантов северного оленя, рекомендован с лечебной и профилактической целью по тем же показаниям, что и пантокрин. Жидкий экстракт (1:1) из пантов самцов северного оленя получают методом реперко-ляции 40 % этанолом. Он представляет собой опалес-цирующую жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом. Используется как субстанция для приготовления таблеток. Состав на одну таблетку: рантарина — 0,5 мл, сахара молочного — 0,2 г, вспо­могательных веществ (крахмал, тальк, кальция сте-арат) — до получения таблеток массой 0,25 г.

Витогепат (Vitohepatum) — водный очищенный экстракт из свежей печени крупного рогатого скота. Измельченную печень обрабатывают дважды водным фосфатным буфером (значение рН 7,5—8,0) при на­гревании и перемешивании, каждый р,аз в продолже-

474

ние 1 ч. В начале экстракции в течение 15 мин тем­пературу поднимают до 110—120 °С. Термическая об­работка (коагуляция) освобождает экстракт от бел­ков. Водный экстракт отделяют фильтрованием или центрифугированием с последующим прессованием твердой фазы на гидравлическом прессе. Извлечения объединяют, охлаждают до 18—20 °С, добавляют кристаллический аммония сульфат, тщательно пере­мешивают и оставляют до отстаивания на 24 ч. Обра­зовавшийся после отстоя аморфный осадок отделяют от жидкой фазы фильтрованием и растворяют в 70 % этаноле при нагревании до температуры 60 °С. Рас­твор сгущают в вакууме до '/is первоначального объ­ема, обезжиривают эфиром. Действующие вещества адсорбируют на угле активированном. Десорбцию осуществляют 77 % этанолом. Элюат упаривают в вакууме при температуре 18—30°С до полного уда­ления этанола. Водный экстракт фильтруют через сте­рилизующие фильтры и разливают в ампулы по 2 мл. Витогепат представляет собой прозрачную жид­кость желтого цвета, значение рН 5,0—6,0, консер­вант— фенол (0,25—0,3%). Стандартизуют по циан-кобаламину (витамин В12), которого должно быть в 1 мл 10 мкг. Препарат содержит также кислоту фо-лиевую и другие антианемические факторы. Хранят в защищенном от света месте, при температуре не выше 20 °С, замерзание недопустимо. Применяют как противоанемическое средство при злокачественном малокровии и других видах анемии.

Контрольные вопросы

1. Как классифицируют препараты из животного сырья? Какие признаки положены в основу различных классификаций?

2. Какие гормональные препараты получают из животного сырья?

3. Укажите стадии технологического процесса получения препа­ ратов высушенных желез.

4. Приведите примеры препаратов, представляющих собой высу­ шенные железы. Какие гормоны они содержат? В каких лекар­ ственных формах выпускают эти препараты?

5. Укажите стадии общей технологии высокоочищенных экстрак­ тов из животного сырья.

6. Назовите экстрагенты и методы экстракции, используемые для получения препаратов из животного сырья.

7. Какие способы очистки применяют для удаления жиров и бал­ ластных белков при получении лекарственных препаратов из животного сырья?

475

8. Из каких стадий состоит общая технология выделения инди­ видуальных гормонов?

9. Укажите способы очистки, применяемые для удаления низко­ молекулярных веществ при получении лекарственных препа­ ратов из животного сырья.

10. Перечислите препараты, получаемые из передней доли гипо­ физа. В каких лекарственных формах их выпускают?

11. Назовите препараты, получаемые из задней доли гипофиза. В каких лекарственных формах их выпускают?

12. Из каких стадий состоит технологический процесс получения инсулина из поджелудочной железы?

13. В чем заключается особенность получения инсулина М?

14. Перечислите препараты инсулина. В каких лекарственных фор­ мах их выпускают?

15. Какие ферментные препараты получают из поджелудочной же­ лезы крупного рогатого скота и в каких лекарственных фор­ мах их выпускают? Как применяют?

16. Укажите ферментные препараты, получаемые из слизистой оболочки желудка свиней, из слизистой оболочки желудка те­ лят и ягнят молочного возраста. В каких лекарственных фор­ мах их выпускают? Как применяют?

17. Назовите ферментные препараты, получаемые из семенников крупного рогатого скота. В каких лекарственных формах их выпускают? Как применяют?

18. Перечислите препараты из животного сырья, относящиеся к препаратам неспецифического действия.

19. Какой препарат получают из печени крупного рогатого скота? В какой лекарственной форме его выпускают?

20. Назовите препараты, получаемые из пант марала и северного оленя. В каких лекарственных формах их выпускают? Как применяют?