18.2. Препараты гормонов

* Гормоны — это вещества, образующиеся в желе-

-.; знстых клетках эндокринных желез, выделяющиеся

. в кровь или лимфу и регулирующие обмен веществ

455

и развитие организма. Гормонам присущи общие биологические признаки: высокая активность, строгая специфичность ^действия и" ег6~ДЖ'танцйонность, Т7е. способность регулировать обмен и функции клеток на расстоянии. По химическому строению они отно­сятся к следующим группам: вещества белкового и полипептидного строения (гормоны "гипофиза, паращитовидной и поджелудочной желез; кальцитонин щитовидной железы), производные аминокислот (ти­роксин и трийодтиронин щитовидной железы), сте_; роидные соединения (гормоны коры надпочечников и половых желез).

Препараты стероидных гормонов, производных

аминокислот и пептидов (окситоцин, вазопрессин)

, получают путем химического синтеза. В настоящее

д ., время синтезированы инсулин и некоторые белковые

гормоны гипофиза (кортикотропин, соматотропин)

и т. д. Однако химический синтез полипептидных

гормонов, состоящих из десятков аминокислотных

остатков, многостадиен, дает малый выход и иерен-

табелен.

Интенсивно развивающиеся физико-химическое и генетическое направления в биологии позволили L создать новые технологии веществ белковой природы. А • Методами генной инженерии получены штаммы — про­дуценты пептидных гормонов: инсулина, соматотро-пина, кальцитонина и др. В отличие от химического синтеза получение гормонов методом биосинтеза явля­ется экономически более эффективным, так как не требует использования катализаторов, высоких темпе­ратур, давления и т. д. В то же время использование биотехнологии позволяет получать гормональные пре­параты, абсолютно идентичные гормонам человека и не являющиеся чужеродными, в отличие от анало­гичных, выделяемых из организма животных. Неко­торые из них, например инсулин и соматотропин человека, разрешены к использованию в медицинской практике.

Однако препараты полипептидных гормонов в ос­новном получают из дорогого и дефицитного сырья.

Препарат гормонов щитовидной железы. Тирео­идин (Thyreoidinum)—высушенная, обезжиренная и измельченная в порошок щитовидная железа круп­ного рогатого скота и свиней. Получают по общей схеме производства сухих органопрепаратов: измель-

456

чение железы, высушивание, обезжиривание, удаление остатков органического растворителя и измельчение полученной массы. Действие тиреоидина обусловлено наличием гормонов: тироксина и трийодтиронина. Препарат стандартизуют по содержанию органически связанного йода, которого должно быть 0,17—0,23 %.

Тиреоидин — мелкий аморфный порошок желто-серого цвета, со слабым запахом, характерным для высушенных животных тканей. Выпускают в виде порошка и таблеток, покрытых оболочкой, по 0,05 и 0,1 г. Хранят по списку Б, в сухом, прохладном, защищенном от света месте. Препарат назначают внутрь при недостаточной функции щитовидной желе­зы и в более высоких дозах — при избыточнй тирео-тропной функции гипофиза.

Препараты гормонов задней доли гипофиза. Адиурекрин или сухой питуитрин (Adiurecrinum seu Pituitrinum siccum) — высушенные, обезжиренные и измельченные в порошок задние доли гипофиза рогатого скота и свиней. Препарат получают по общей схеме изготовления сухих органопрепаратов. Гипофиз отделяют и консервируют в ацетоне. Перед производством вынимают из ацетона, отделяют зад­нюю долю, разрезают ее на 3—4 части и сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. Сухой материал обрабатывают эфиром в аппа­рате «Сокслета» до полного обезжиривания. Остаток экстрагента удаляют высушиванием под вакуумом. Высушенные, обезжиренные задние доли гипофиза превращают в порошок в шаровой мельнице.

Препарат содержит гормоны задней доли гипофи­за: антидиуретический (вазопрессин) и окситоцин. Активность адиурекрина определяют биологическим методом по способности повышать артериальное давление у крыс; 1 мг содержит 1 ЕД.

Адиурекрин представляет собой аморфный порошок серого цвета с желтоватым оттенком и специфическим запахом. Выпускают в стеклянных флаконах по 1; 5 и 10 г. Хранят по списку Б, в прохладном месте. Применяют в качестве антидиуретического средства при несахарном мочеизнурении и ночном недержании мочи. Порошок вводят в полость носа при легком вдыхании. Действие наступает через 15—20 мин, продолжается 6—8 ч.

Питуитрин для инъекций (Pituitrinum

457

pro injectionibus) — экстракт аадней доли гипофиза крупного рогатого скота и свиней, очищенный от балластных белков. Препарат получают путем экс­тракции измельченных задних долей гипофиза водой, подкисленной кислотой хлороводородной до значения рН 2,5, при температуре +40 °С в течение 1 ч. К экс­тракту добавляют 20 % раствор натрия гидрооксида до значения рН 4,8—5,5 для осаждения балластных белков. Надосадочную жидкость нагревают до кипения для полного удаления белков и фильтруют. В фильтра­те устанавливают значение рН 3,0—4,0, в качестве консерванта добавляют 0,25—0,3 % фенола, стерили­зуют фильтрованием и разливают в ампулы.

Питуитрин — прозрачная бесцветная жидкость кислой реакции. Действующими веществами являются окситоцин и вазопрессин. Стандартизуют биологиче­ским методом: по способности вызывать сокращение изолированного рога матки морской свинки, 1 мл должен содержать 5 ЕД. Выпускают в ампулах по 1 мл. Хранят по списку Б, в защищенном от света месте, при температуре от + 1 до + 10 °С. Применяют для возбуждения и усиления сократительной деятель­ности матки.

Препараты гормонов передней доли гипофиза. Для медицинских целей из передней доли гипофиза животных выделяют адренокортикотропный (АКТГ), лактогенный и тиреотропный гормоны.

Один из способов промышленного производства гормонов из гипофиза свиней, разработанный во ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов (ВНИИТК.ГП), предусматривает ком­плексное использование исходного сырья и последова­тельное выделение отдельных гормонов передней доли гипофиза. В основу способа положена однократная экстракция гормонов из измельченных тканей перед­них долей гипофиза свиней подкисленным водным 80 % ацетоном. Кислый водно-ацетоновый экстракт отделяют центрифугированием. Жмых собирают и ис­пользуют для получения тиреотропного гормона для медицинской практики, а также . соматотропного, фоликулостимулирующего и лютенизирующего гормо­нов, применяемых в ветеринарии. Экстракт, отделен­ный центрифугированием, содержит АКТГ и лакто­генный гормон, которые осаждают ацетоном, повышая его концентрацию в смеси до 92 %, и отстаиванием

458

на холоду при температуре — 2—5 °С в течение jq—12 ч. Осадок— кислый ацетонированный порошок (КАП) отделяют, промывают на нутч-фильтре охлаж­денным 98 % ацетоном и высушивают на воздухе до полного его удаления. КАП растворяют в воде, подкисленной кислотой уксусной, и, добавляя раствор аммиака, доводят до значения рН 5,0. В изоэлектри-ческой точке осаждается лактогенный гормон. Осадок отделяют центрифугированием и используют для полу­чения препарата — лактина.

Раствор после отделения лактогенного гормона разбавляют аммонийно-ацетатным буфером (рН 5,0) и пропускают через колонку, заполненную катионитом КМ-сефадекс К-25. По окончании процесса сорбции кортикотропина на ионообменной смоле проводят его десорбцию этанольным раствором аммонийно-ацетатного буфера. Из элюата АКТГ осаждают этанолом. Осадок отделяют центрифугированием, промывают этанолом, ацетоном и высушивают на воздухе. Стандартизуют АКТГ биологическим мето­дом, активность выражают в единицах действия (ЕД). Для приготовления лекарственных форм используют субстанцию АКГТ активностью 70—90 ЕД/мг.

Кортикотропин для инъекций (Corti-cotropinum pro injectionibus) — порошок АКТГ с со­держанием 70—90 ЕД/мг растворяют в воде, имеющей значение рН 3,0—5,0 и температуру 5 °С. Раствор фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке. Стерильный лиофилизированный порошок выпускают в* герметически укупоренных флаконах, содержащих 10—20—30—40 ЕД кортикотропина. Хранят по списку Б, в защищенном от света месте, при температуре не выше 20 °С. Применяют кортикотропин в основном при вторичной гипофункции коркового вещества над­почечников и при ревматизме, бронхиальной астме, разных аллергических и других заболеваниях. Корти­котропин оказывает кратковременное действие. Для получения лечебного эффекта его необходимо вводить несколько раз в сутки.

Суспензия ц и н к-к о р т и ко т р о п и н a (Sus-pensio Zinc-corticotropini) — препарат пролонгирован­ного действия. Суспензия — стерильная, белого цвета, содержит 20 ЕД кортикотропина в 1 мл, цинка хлорид, глицерин, консервант (0,25 % фенола), значение

459

pH 7,0—8,0. Выпускают во флаконах по 5 мл. Вводят внутримышечно по 10, 20 или 40 ЕД (0,5; 1,0 или 2,0 мл) 1 раз в сутки. Лечебный эффект начинается через 8—10 ч и длится более 24 ч. Хранят по списку В, при температуре от 1 до 10 °С. Не допускается за­мораживание.

Л актин для инъекций (Lactinum pro injectionibus) — стерильный лиофилизированный по­рошок белого цвета. Для получения препарата лакто-генный гормон растворяют в воде для инъекций, фильтруют через стерилизующие фильтры, разливают во флаконы и подвергают сублимационной сушке. Выпускают в герметически укупоренных флаконах вместимостью 5 мл, содержащих по 100 или 200 ЕД. Хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре от 15 до 20 °С. Применяют для стимуля­ции лактации в послеродовом периоде.

J

Тиротропин для инъекций (Thyrotropi-num pro injectionibus) — стерильный лиофилизирован­ный порошок светло-желтого цвета. Выпускают в гер­метически укупоренных флаконах вместимостью 5 мл, содержащих по 10 ЕД. Хранят в сухом, прохладном, защищенном от света месте, при температуре не выше 10 °С. Применяют для диагностики гипотиреоза и как лечебное средство при недостаточности щитовидной железы.

гормона попжрпуппицой железы. Ингу-

Jflp р

"ин—(Insulinum) — гормон поджелудочной железы, продуцируется в р-клетках, находящихся в ткани островков Лангерганса. Инсулин является белком с молекулярной массой около 6000, имеющим 51 ами­нокислоту и две цепи: А, состоящую из 21, и В — из 30 аминокислот, соединенных дисульфидными мости­ками.

Сырьем для получения инсулина является подже­лудочная железа рогатого скота и свиней. Ввиду на­личия в поджелудочной железе фермента трипсина получение инсулина долгое время оставалось без­результатным. В 1921 г. канадские исследователи Ф. Г. Бентинг и Ч. X. Бест впервые выделили инсулин из поджелудочной железы при обработке ее подкис­ленным крепким этанолом. При этом ферменты инакти-вируются и теряют способность разрушать инсулин. В настоящее время известно несколько технологий выделения инсулина, которые отличаются друг от

460

друга лишь в деталях. Свежие или замороженные ткани железы измельчают на мясорубке-волчке и экстрагируют способом бисмацерации в эмалирован­ном реакторе с мешалкой. В качестве экстрагента для первой мацерации используют 80—85 % этанол, для второй — 57 % этанол, подкисленный кислотой ортофосфорной (серной, хлороводородной) до значе­ния рН 2,8—3,0. Экстракцию проводят 1,5—4 ч при перемешивании. Экстракты отделяют фильтрованием или центрифугированием, объединяют и проводят очистку.

^Предварительная, грубая очистка экстракта одина­кова по всем технологиям, она сводится к удалению анионов _кислот. Так, анион кислоты ортофосфорной (POr^J) "удаляют раствором кальция хлорида при значении рН 3,3—3,8/2)3атем осуществляют депро-теинизацию — последовательное отделение балластных белковых веществ при значении рН 4.5—5,1. и 3,5 при температуре JJJ|O. Выпадающие осадки отделяют центрифугированием'ЯПрозрачный экстракт концентри­руют выпариванием на вакуум-дистилляционной уста­новке пленочного типа при температуре не выше 30 °С до содержания этанола 10—25 % в возможно более короткий срок, при строгом соблюдении темпе­ратурного режима, так как длительное нагревание приводит к инактивации инеулина@Концентрирован-ный остаток очищают от липидов и балластных белков отстаиванием "на холоду (0—4 °С) при значении рН 3,0—3,3. От всплывшего слоя липидов и осадка балластных белков экстракт отделяют фильтрованием. Из сгущенного, очищенного экстракта инсулин-сырец выделяют двукратным высаливанием 25 % раствором натрия хлорида или 40 % раствором аммония суль­фата. Этот способ используется на некоторых заводах с 1928 г. по настоящее время.

Наиболее прогрессивным является способ выделе­ния инсулина ионообменной хроматографией, разра­ботанный и внедренный в 1970 г. на Минском заводе медпрепаратов. По этому способу операцию упарива­ния исключают, а осуществляют сорбцию инсулина из экстракта, частично освобожденного от балластных белков, на отечественном макропористом сульфо-катионите КУ-33-30/100 при значении рН 3,0—3,3 в режиме псевдоожижения. Для удаления жира катионит промывают 65—67 % этанолом, а для отде-

461

ления балластных белков — 0,3 М раствором ацетат­ного буфера (рН 5,3). Десорбцию инсулина проводят 0,01—0,05 М раствором аммонийного буфера (рН 9,8—10,0). Инсулин неустойчив в щелочной среде, поэтому десорбируют его быстро, элюат немедленно подкисляют кислотой хлороводородной до значения рН 4,1—4,5 и добавляют ацетон. Осадок балластных веществ удаляют. Инсулин осаждают в виде цинк-инсулииа раствором цинка ацетата (рН 6,1—6,2), очищают кристаллизацией. Цинк-инсулин растворяют в воде, подкисленной кислотой лимонной до значения рН 2,6—2,8. Раствор отстаивают в течение 1 ч и вы­павший осадок балластных белков удаляют фильтро­ванием через кизельгур. Фильтрат смешивают с ацето­ном, добавляют цинк хлористый и фенол, охлаждают до температуры 0 °С, создавая условия для медленной кристаллизации инсулина. Раствор подщелачивают до значения рН 8,0—8,5; оставляют на 2—-3 мин, затем создают значение рН 6,7—6,8 и перемешивают 1 ч; при значении рН 6,5 перемешивают 2 ч; при значении рН 6,2 и 6,0 перемешивают 2 ч и отстаивают 18—20 ч и при значении рН 5,8 перемешивают 2 ч и отстаивают 48—96 ч при температуре 5 °С. Выпавшие кристаллы инсулина отделяют центрифугированием, промывают на воронке Бюхнера ледяной водой дистиллированной, ацетоном и эфиром. Досушивают инсулин на воздухе, в вытяжном шкафу и эксикаторе.

Активность инсулина определяют биологическим nvTeMj по способности понижать содержание саха"ра в крови у здоровых кроликов. За единицу действия принимают активность 0,04082 мг кристаллического инсулина (стандарта), она должна бытьГ24—26 ЕХГ⁴ в 1 мг.

Препараты кристаллического инсулина. Инсу­лин для инъекций (Iirsulinum pro injectioni­bus) получают растворением кристаллического инсу­лина с активностью 24—26 ЕД/мг в воде, подкислен­ной кислотой хлороводородной до значения рН 3.0—3 5. К раствору добавляют солюбилизатор (1,6—1,8 % глицерина) и консервант (0,25—0,3 % фенола). Раствор стерилизуют фильтрованием через стерилизующие фильтры.

Суннсулин (Suinsulinum) — раствор кристал­лического инсулина, получаемого из поджелудочной железы свиней, в ацетатном буфере. Раствор имеет

462

значение рН 7,0—7,5,. содержит консервант — нипагин.

Инсулин для инъекций и суинсулин применяют при лечении диабета, вводят под кожу или внутримышеч­но. В случаях необходимости неотложной помощи ■ больному, например при диабетической коме, вводят внутривенно. Действие препаратов при введении под кожу или внутримышечно развивается через 15—20 мин и продолжается около 6 ч. Суинсулин реже вызывает аллергические реакции, применяется при осложнениях после инъекций инсулина, полученного из поджелу­дочной железы крупного рогатого скота, и при резн-стентности к инсулину.

Недостатком растворов инсулина является непро­должительность действия, поэтому выпускают ряд пролонгированных препаратов.

Суспензия инсулин-протамина для инъекций (Suspensio insulin-protamini pro injecti--onibus) — первый препарат инсулина продленного действия, получен смешиванием раствора кристалли­ческого инсулина с протамином сульфата (белок из молоки осетровых рыб). При контакте с тканями инсулин постепенно отделяется от протамина и снижа­ет содержание сахара в крови. Эффект наступает через 2—4 ч, достигает максимума через 8—12 ч и продолжается 16—18 ч.

Протамн н-ц и н к-и и с у л и н для инъе к-цнй (Protamin-zinc-insulinum pro injectionibus) полу­чают при добавлении небольшого количества цинка хлорида к инсулин-протамииу, что еще больше про­лонгирует действие последнего. Эффект препарата наступает через 3—6 ч после инъекций, достигает максимума через 14—20 ч и продолжается 24—36 ч. Препарат представляет собой стерильную суспензию белого цвета, в фосфатном буфере, значение рН ^ВД^Зсервант — фенол (0,25—0,3%).

пределенный успех в инсулинотерапии вызван появлением трех инсулинов пролонгированного дей­ствия — суспензий цинк-инсулина. Их получают сме­шиванием стерильных растворов кристаллического ин­сулина с цинка хлоридом и буферным раствором. ■Изменяя порядок смешивания и длительность пере­мешивания, можно осадить две физические фракции Цинк-инсулина: аморфную и кристаллическую. Суспен­зию аморфного цинк-инсулина (величина частиц не превышает 2 мкм) получают при кратковременном

463

перемешивании растворов, суспензию кристаллическо­го — при медленном перемешивании (30—40 об/мин) в течение 18—20 ч. При этом формируются кристаллы ромбовидной формы величиной 10—40 мкм. Суспензии цинк-инсулина стабильны при нейтральном значении рН. Состав препаратов на 100 ЕД инсулина, мг: натрия ацетата — 3,4; натрия хлорида — 17,5; цинка хлорида — 0,20; значение рН 7,1—7,5; фенола — 0,25—0,3 %. Введенные подкожно суспензии цинк-инсулина постепенно всасываются и вызывают сни­жение сахара в крови, продолжительность которого зависит от физического состояния цинк-инсулина.

Суспензия цинк-инсулина аморфного для инъекций (Suspensio Zinc-insulini amorphi pro injectionibus) проявляет быстрое действие — через 1 —1,5 ч, но оно сравнительно короткое — длитель­ностью 10—12 ч.

Суспензия цинк - инсулина кристал­лического для инъекций (Suspensio Zinc-insu­lini crystallisati pro injectionibus — препарат наиболее длительного действия, снижение сахара в крови на­ступает через 6—8 ч, достигает максимума через 16— 20 ч и продолжается 30—36 ч.

Суспензия цинк-инсулина для инъек­ций (Suspensio Zinc-insulini pro injectionibus) —пре­парат со средней продолжительностью действия. Его получают смешиванием суспензий цинк-инсулина аморфного и кристаллического в отношении 3 : 7_. Сни­жение сахара в крови при введении под кожу насту­пает через 2—4 ч, умеренно усиливается к 5—7 ч, достигает максимума через 8—10 ч и продолжается 20—24 ч. Этот препарат позволяет многим больным обходиться одной инъекцией в сутки.

Препараты инсулина выпускают во флаконах вмес­тимостью 5 или 10 мл, укупоренных резиновыми проб­ками с последующей металлической обкаткой. Актив­ность инсулина 40 и 80 ЕД в 1 мл. Хранят по спис­ку Б, в защищенном от света месте, при температуре от 1 до 10 °С. Замораживание не допускается.

Инсулин М и его препараты. В 1983 г. в ВНИИТКГП разработана технология инсулина М, не содержащего проинсулина и балластных белков, опре­деляющих способность препаратов повышать иммун­ные реакции организма. Дополнительная очистка кристаллического инсулина осуществлена ионообмен-

464

ной хроматографией на макропористом анионите оте­чественного производства АВ-171-40/100 и повторной перекристаллизацией.

Кристаллический инсулин растворяют в 40 % эта­ноле с добавлением динатриевой соли этилендиамин-тетрауксусной кислоты, связывающей ионы цинка и таким образом повышающей его растворимость. Кон­центрированный раствор инсулина центрифугируют и сорбируют на анионите АВ-171-40/100. Элюируют инсулин раствором аммонийного буфера, содержащим 40 % этанола, натрия хлорид, значение рН 7,4—7,6. Собирают фракции элюата, содержащие хроматогра-фически чистый инсулин. Кристаллизуют инсулин из цитратного буфера, содержащего цинка хлорид и 20 % этанола, при значении рН 6,9 и 5,8. Получают высо-коочищенный инсулин с активностью не ниже 26 ЕД/мг.

На основе суинсулина М, полученного из подже­лудочной железы свиней, созданы высокоочищенные препараты, аналогичные препаратам кристаллического инсулина, но характеризующиеся низкой антигенной активностью. Раствор суинсулина М (Suinsulinum M) в ацетатном буфере в отличие от раствора кристал­лического инсулина имеет не кислую, а нейтральную реакцию, значение рН 7,0—7,5. Препараты продлен­ного действия — суспензии: цинк-инсулина М аморф­ного для инъекций или инсулин-семилонг (Insulin semilong), цинк-инсулина кристаллического для инъ­екций или инсулин-ультралонг (Insulin ultralong) и цинк-инсулина М для инъекций или инсулин лонг (Insulin long).