Лабораторная работа № 1 Общие правила в микробиологии
Санитарно-микробиологические исследования объектов окружающей среды, в том числе пищевых продуктов, смывов, воды, воздуха, почвы, различных материалов и др. направлены на профилактику пищевых отравлений желудочно-кишечных заболеваний, связанных с употреблением в пищу контаминированных различными возбудителями пищевых продуктов, что является конечной целью санитарно-микробиологического контроля.
Санитарно-микробиологические исследования позволяют эпидемиологам и гигиенистам оценить опасность объектов окружающей среды как вероятных факторов передачи возбудителей кишечных респираторных и иных инфекций.
Правила отбора проб для исследования, подготовки, культивирования, выявления и определения микроорганизмов строго регламентируются нормативными актами - стандартами, санитарными правилами и нормами, методическими документами.
Задание: ознакомиться с содержанием следующих документов:
ГОСТ Р 51446 "Продукты пищевые. Общие правила в микробиологии".
ГОСТ 26668 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".
ГОСТ 26669 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
ГОСТ 26670 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".
ГОСТ 10444.1 "Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".
Материалы: ГОСТ Р 51446, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26670, ГОСТ 10444.1
Контрольные вопросы
Основные требования к помещениям.
Аппаратура и оборудование.
Требования к персоналу.
Подготовка оборудования.
Общие правила приготовления питательных сред и реактивов. Сроки хранения питательных сред.
Общие правила при отборе проб, транспортировке, приёмке, хранении и обеззараживании лабораторных образов:
асептический способ отбора проб (способы стерилизации инструментов, посуды);
с какой целью проводится внешний (визуальный) осмотр образцов?
каким образом устанавливается масса (объём) пробы для проведения микробиологического анализа?
методы отбора от кусковой продукции, жидкой или пастообразной, от сыпучей, смешанной консистенции.
Методы исследований и обработки результатов:
приготовление исходной суспензии и последующих разведений;
методы посева (глубинный метод в плотные среды, поверхностный метод посева на плотные питательные среды, метод посева в жидкие среды, метод мембранных фильтров);
термостатирование;
обработка результатов;
8. Основные методы идентификации микроорганизмов.
Лабораторная работа № 2 Микробиологические методы исследования
Микробиологические исследования объектов окружающей среды проводятся стандартными методами, позволяющими получить достоверные результаты.
Определение количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ, ГОСТ 10444.15)
Метод основан на высеве продукта или разведения навески продукта в питательную среду, инкубировании посевов, подсчёте всех выросших видимых колоний.
Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669.
1 см3 материала из исходного разведения (10-1) переносят в пробирку с 9 см3 стерильного раствора для разведения, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке, перемешивают новой стерильной пипеткой и содержимое в количестве 1 см3 переносят в следующую пробирку и т.д. В результате исследуемый продукт оказывается разведенным в 10, 100 и более раз. Степень разведения навески для высева на плотные среды выбирают так, чтобы общее количество колоний, выросших на чашке, колебалось в пределах от 15 до 300. В две чашки Петри параллельно вносят 1 см3 разведенного продукта или смыва, заливают расплавленным и остуженным до 45°С агаром (15-20 см3), размешивают. После застывания агара чашки переворачивают и помещают в термостат при температуре 30°С на 72 ч. При необходимости допускается предварительный учет колоний через 48 ч с последующим подсчетом через 72 ч.
Обработку результатов культивирования проводят согласно ГОСТ Р51446-99. Количество микроорганизмов в 1 г пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле:
(1)
где ΣC - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний;
V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см3;
n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении;
n2 - количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;
d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.
Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см3 или в 1 г, выраженное в виде числа от 1.1 до 9.9, умноженного на 10 в соответствующей степени.
Если при посевах оказалось, что во всех разведениях на засеянных чашках менее 30 колоний, в результатах анализа рекомендуется писать: «Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)». При отсутствии роста колоний результаты выражают таким образом: «Количество микроорганизмов менее 1». Если на чашках более чем на половине их площади имеется рост спорообразующих микроорганизмов или за счет споровых микроорганизмов подсчет изолированных колоний невозможен, в результате анализа следует написать: «Рост спорообразующих микроорганизмов». Результаты выражают в колониеобразующих единицах - КОЕ (г, см3, см2).
Выделение и определение количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (ГОСТ 30518-97)
Метод основан на высеве определенного количества продукта и (или) разведения навески продукта в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании посевов, учете положительных пробирок, пересеве, при необходимости, культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды для подтверждения по биохимическим и культуральным признакам роста принадлежности выделенных колоний к колиформным бактериям.
Основой этого метода является способность БГКП сбраживать в среде Кесслер лактозу с образованием кислоты и газа. В этой группе определяется 5 родов энтеробактерий: E.coli, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia.
Для определения БГКП из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведении по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см3) продукта предполагаемое количество колиформных бактерий или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.
При определении БГКП в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред (например в Кесслер). Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:9. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч. При положительной реакции (изменение цвета среды, помутнение, газ) делают пересев на плотную дифференциальную среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют дном вверх при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
На среде Эндо колиформные бактерии образуют колонии бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.
При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к колиформным бактериям из чашек Петри с посевами отбирают не менее, чем по пять колоний. Из каждой отобранной колонии готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.
У грамотрицательных культур определяют возможность ферментации углеводов с образованием кислоты. Для этого суточные культуры пересевают в среды: Гисса, трехсахарный агар, посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч.
К колиформным бактериям относят аэробные и факультативно-анаэробные, не образующие спор грамотрицательные палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа.
Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus (ГОСТ 10444.2-94)
Метод выявления и определения S. aureus посевом с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и (или) разведения навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных характерных колоний к S. aureus.
Для выявления S. aureus навеску продукта или его разведение вносят в солевой бульон. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 48ч.
Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них после инкубирования делают пересев петлей на поверхность селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч.
После инкубирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На молочно-солевом агаре колонии S. aureus круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашены в желтый золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет.
На желточно-солевом агаре колонии окружены зоной лецитиназной активности.
Для подтверждения принадлежности характерных колоний к S.aureus отбирают не менее 5 колоний и пересевают на поверхность скошенного рыбопептонного агара, посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.
Если при испытании характерных колоний в них обнаружены грамположительные кокки диаметром 0,6-1 мкм располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу и ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то считают, что выявленные микроорганизмы относятся к S.aureus.
Определение бактерий рода Salmonella (ГОСТ 30519-97)
Метод основан на способности бактерий рода Salmonella на дифференциально-диагностических средах образовывать специфические колонии и давать реакцию агглютинации с сальмонеллезными сыворотками.
К бактериям р. Salmonella относятся грамотрицательные палочки с закругленными концами, длина варьирует от 1 до 3 мк, ширина - 0,5-0,6 мк; факультативно-анаэробные, подвижные, оптимальная температура роста 37°С, реакция слабощелочная (рН 7,2-7,4).
Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода сальмонелл (25 грамм), высевают в забуференную пептонную воду. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9 (неселективное предварительное обогащение).
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 18-24 ч. Культуры, полученные после инкубирования, пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см3 культуры переносят в 100 см3 магниевой и в 100 см3 тетратионатной среды или по 10 см3 в 100 см3 селенитовой среды и в 100 см3 тетратионатной среды. Посевы инкубируют в течение 24-48 ч на магниевой и селенитовой средах при температуре (36±1)°С, а на тетратионатной среде при (43±1)°С.
Культуры после инкубирования пересевают (по ГОСТ 26670) на три агаризированные среды: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева и среду Эндо (или среду Левина).
Допускается использование одной чашки каждой из сред для одновременного высева с двух селективных сред.
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч. После 24 ч инкубирования посевов проводят предварительный учет результатов, а после 48 ч - окончательный. Отмечают на дифференциально-диагностических средах рост колоний, характерных для бактерий рода сальмонелла:
на висмут-сульфит агаре колонии черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями;
на среде Плоскирева колонии бесцветные, прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо;
на среде Эндо колонии круглые, бесцветные или слегка розоватые, прозрачные;
на среде Левина колонии прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые.
При отсутствии в посевах на дифференциально-диагностических средах характерных для бактерий рода Salmonella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске продукта.
При наличии хотя бы на одной дифференциально-диагностической среде характерных для бактерий рода Salmonella колонии проводят их дальнейшее изучение.
Не менее трех колоний с каждой дифференциально-диагностической среды пересевают на скошенную поверхность рыбо-пептонного агара, и часть колоний пересевают штрихом на поверхность и уколом в столбик трехсахарного агара.
Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч.
Из отобранных для биохимического подтверждения колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (по ГОСТ 10444-3).
Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.
После инкубирования посевов проводят учет результатов ферментации лактозы, глюкозы и сахарозы на трехсахарном агаре (биохимическое подтверждение):
пожелтение скошенной части среды указывает на ферментацию лактозы или сахарозы или обоих сахаров;
пожелтение столбика среды с разрывом агара или пузырьками газа указывает на ферментацию глюкозы с образованием газа;
пожелтение столбика среды без разрывов или пузырьков газа указывает на ферментацию глюкозы без образования газа;
почернение среды в столбике указывает на образование сероводорода.
Типичными для бактерии рода Salmonella являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород.
Дальнейшему изучению подвергаются также лактозоположительные бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.
У культур, отобранных и пересеянных на поверхность рыбо-пептонного агара изучают возможность расщепления мочевины, образования ацетоина и индола, ферментации сахарозы и маннита, и подвижность.
Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину, не образуют ацетоин, индол, не сбраживают сахарозу и манит, большинство штаммов бактерий рода Salmonella подвижны. После биохимического подтверждения проводят серологическое подтверждение принадлежности культур к бактериям рода Salmonella.
Метод определения плесневых грибов и дрожжей (ГОСТ 10444.12-88)
Метод основан на высеве продукта или гомогената продукта и (или) их разведений в питательные среды, определении принадлежности выделенных микроорганизмов к плесневым грибам, дрожжам по характерному росту на питательных средах и по морфологии клеток.
Масса (объем) навески, предназначенной для приготовления гомогената продукта или исходного разведения - не менее (10±0,1) г (см3).
Плесневые грибы и дрожжи способны расти на селективных средах в аэробных условиях при термостатировании посевов при температуре (24±1)°С.
Продукт и (или) его разведение высевают по ГОСТ 26670-85 параллельно в две чашки Петри и заливают по 15-20 см3 средой Сабуро синтетической с антибиотиками. Чашки вверх крышками ставят в термостат при температуре (24±1°С). Через 5 суток посевы просматривают.
Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.
Рост дрожжей сопровождается образованием выпуклых, блестящих, серовато-белых, кремовых колоний с ровными краями.
При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопирование. Результаты микроскопирования оценивают по ГОСТ 10444.12-88.
Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.
Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дают заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.
Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов. Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г или в 1 см продукта вычисляют по формуле:
(2)
где ΣC - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний;
n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении;
n2- количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;
n - степень разведения продукта.
Результаты испытания записывали в соответствии с требованиями ГОСТ 26670-85.
Определение парагемолитических вибрионов («Методические указания по контролю в рыбной продукции парагемолитических вибрионов-возбудителей пищевых токсикоинфекций». Л., 1991)
Метод основан на выявлении типичных колоний на дифференциально-диагностических средах определенного состава и установлении принадлежности бактерий к парагемолитическим вибрионам по морфологическим и биохимическим свойствам.
Для определения количества парагемолитических вибрионов в 1 г продукта делают высев из разведений.
Для приготовления разведений из пробы отбирают навеску массой 25 г и измельчают в стерильной ступке. Добавляют 225 см3 0,1% пептонной воды с 3% хлорида натрия (разведение 10-1), размешивают, отстаивают в течение 5 мин, из надосадочной жидкости готовят последующие разведения.
Чтобы получить высев 0,1 г продукта засевают из разведения 10-1 по 0,2 см3 надосадочной жидкости на 5 чашек с плотной дифференциально-диагностической средой (ДДА). Из разведения 10-2 высевают по 0,1 см3 на две параллельные чашки, что соответствует посеву по 0,001 г продукта на одной чашке. При необходимости засевают последующие разведения. Посевы инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 24 ч. Производят подсчет типичных колоний. На ДДА вибрионы образуют плоско-выпуклые прозрачные колонии круглой формы с ровными краями, влажной, гладкой, блестящей поверхностью голубовато-зеленого цвета от 1 до 5 мм в диаметре. Результаты роста на ДДА оценивают следующим образом:
отсутствие роста парагемолитических вибрионов на всех пяти чашках посева из разведения 10-1 означало, что в одном грамме парагемолитические вибрионы отсутствуют или содержатся в количестве менее 10 клеток;
обнаружение роста 10-50 типичных колоний на пяти чашках посева из разведения 10-1 при отсутствии роста на двух чашках с посевом при разведении 10-2 указывало, что в 1 г продукта содержится от 100 до 500 жизнеспособных клеток парагемолитических вибрионов.
Для подтверждения принадлежности выделенных на дифференциально-диагностической среде микроорганизмов к парагемолитическим вибрионам проводят изучение морфологических свойств и ставят биохимические тесты.
Парагемолитические вибрионы - мезофильные грамотрицательные палочки, прямые или слегка изогнутые, не образующие спор, активно подвижны, содержат цитохромоксидазу, не расщепляют лактозу и сахарозу, растут на питательных средах с содержанием хлорида натрия от 3 до 8 %, декарбоксилируют лизин, образуют индол, ферментируют (без газообразования) арабинозу, глюкозу, мальтозу, не образуют ацетилметилкарбинол.
Определение сульфитредуцирующих клостридий (ГОСТ 29185-91)
Метод основан на высеве определенного количества продукта и (или) его разведений в железосульфитсодержащие среды, инкубировании посевов при (37±1)°С не более 72 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам к сульфитредуцирующим клостридиям.
При определении присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из вязких питательных сред (железосульфитный агар или среда Вильсона-Блера). Перед посевом в питательную среду навеска продукта или его эквивалентное разведение прогреваются при (80±1)°С, 20 минут на водяной бане.
Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С не более 72 ч. Ежедневно посевы просматривают для обнаружения признаков роста сульфитредуцирующих микроорганизмов - почернения сульфитной среды.
Из посевов отбирают пробирки с признаками роста - отдельными черными колониями или полностью почерневшей питательной средой на глубине свыше 1 см. Из отобранных пробирок проводят пересевы петлей в чашки Петри на железосульфитный агар или среду Вильсона-Блера. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при температуре (37±1)°С в течение 18-72 ч.
Для сульфитредуцирующих бактерий характерен анаэробный рост.
Из выросших культур готовят два препарата и окрашивают, первый - по Граму, второй - для выявления бактериальных спор. Проводят тест на каталазу.
Сульфитредуцирующие клостридии - грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно, в виде цепочек или скоплений параллельных клеток. При спорообразовании споры овальные или сферические, субтерминальные или терминальные. Сульфитредуцирующие клостридии каталазу не образуют, строгие анаэробы.
Метод выявления и определения количества энтерококков (ГОСТ 28566-90)
Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведения в жидкую селективную среду или на поверхность плотной селективной среды, аэробном культивировании посевов при 37 0С в течение 24-48 ч, подтверждении принадлежности выросших микроорганизмов к энтерококкам.
При выявлении энтерококков из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведении по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить минимальное количество продукта, содержащее энтерококки.
Навеску продукта (в количестве 1г) и его разведение (в количестве 1 см3) высевают непосредственно в 5 см3 щелочной полимиксиновой среды.
Посевы инкубируют при (37±1)°С в течение 24-48 ч. Через 24 ч проводят предварительный учет результатов, через 48 ч - окончательный.
После инкубирования посевов, учитывают пробирки с признаками роста микроорганизмов: помутнение среды и изменение ее окраски в желтый цвет. Из пробирок с признаками роста, предположительно энтерококков, делают пересевы на поверхность агаризованной молочно-ингибиторной среды (МИС), посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч.
Через 24-48 ч инкубирования просматривают и отмечают рост колоний, характерных для энтерококков.
На молочно-ингибиторной среде с теллуритом калия колонии окрашены в черный цвет.
Для подтверждения принадлежности характерных колоний к энтерококкам готовят препараты, окрашивали по Граму по ГОСТ Р 51446.
Энтерококки - грамположительные кокки, расположенные парами, короткими или длинными цепочками.
У колоний определяют наличие каталазы по ГОСТ Р 51446.
Энтерококки каталазу не образуют.
После подтверждения принадлежности характерных колоний к энтерококкам оценивают результаты по каждой пробе отдельно.
При посеве навески продукта или его разведения в жидкие среды, пробирки считатают положительными, если при последующем пересеве на МИС вырастают колонии черного цвета, каталазоотрицательные, а после окраски по Граму и микроскопирования обнаруживают грамположительные кокки, расположенные парами, короткими или длинными цепочками.
Результаты выявления энтерококков в определенной навеске записывают: энтерококки обнаружены или не обнаружены (при этом указывается навеска продукта).
Для определения количества энтерококков 0,1 или 0,2 см3 продукта или его разведения высевают по ГОСТ 26670 на поверхность предварительно подсушенной агаризированной питательной среды (МИС). Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 24-48 ч, после инкубирования учитывают чашки на которых выросло от 15 до 120 колоний.
На МИС колонии энтерококков черного цвета, далее проводят подтверждение принадлежности выросших колоний к энтерококкам.
Метод определения молочнокислых микроорганизмов (ГОСТ 10444.11-75)
Сущность метода заключается в способности молочнокислых бактерий образовывать молочную кислоту и давать вокруг колоний на агаризованной среде с углекислым кальцием «зоны просветления» или изменять цвет индикатора при развитии в жидкой среде.
Для определения молочнокислых бактерий из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведении по ГОСТ 26669.
1 см3 пробы продукта помещают параллельно в две чашки Петри с 30 см3 из разведённого капустного агара.
Посевы термостатируют при 30±0,5°С до появления видимого роста, но не более 5 суток.
Появление зон растворения мела вокруг колоний на капустном агаре является одним из признаков присутствия молочнокислых бактерий в посевах.
Молочнокислые бактерии образуют на агаризованных средах мелкие гладкие или шероховатые колонии, обычно медленно растущие в глубине или реже на поверхности среды; некоторые молочнокислые бактерии могут образовывать на поверхности слизистые колонии. При развитии молочнокислых бактерий, образующих газ, наблюдаются разрывы агаризованной среды.
Принадлежность выросших культур к молочнокислым бактериям определяют по характерным признакам, выявляемым при микроскопировании, и по результатам пробы на каталазу (ГОСТ Р 51446).
При микроскопировании устанавливают подвижность клеток, морфологию, отношение к окраске по Граму (ГОСТ Р 51446) и отсутствие спорообразования.
Молочнокислые бактерии, кокки или палочки, обычно неподвижны, не образуют спор, грамположительны.
Молочнокислые бактерии каталазы не образуют.
При отсутствии роста молочнокислых бактерий в посевах пробы указывают на отсутствие этой группы микроорганизмов в продукте.
Определение бактерий рода Proteus (ГОСТ 28560-90, Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных № 5319-91)
Метод основан на способности бактерий рода Proteus расти на питательных средах в виде ползучего вуалеобразного опалесцирующего налёта с образованием гнилостного запаха.
Из продукта и (или) соответствующих разведений высевают по 1 см3 в рыбопептонный бульон, посевы инкубируют при (36±1)°С, в течение 48 ч. Положительными считаются пробирки, в которых наблюдается помутнение среды.
Для определения бактерий рода Proteus две капли из рыбопептонного бульона вносят в конденсационную воду свежескошенного рыбопептонного агара, не касаясь поверхности среды, засеянные пробирки инкубируют при (36±1)°С, через 18-24 ч просматривают, обращая внимание на образование ползучего вверх вуалеобразного налёта с голубоватым оттенком, неприятным гнилостным запахом.
Для подтверждения принадлежности выросших колоний к бактериям рода Proteus делают пересев методом укола и штрихом по поверхности трёхсахарного агара. Посевы инкубируют 48 ч (36±1)°С. При образовании сероводорода столбик среды чернеет, появляется газ, что указывает на ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа.
Допускается инкубирование посевов при отсутствии сероводорода через 48 ч продолжать до 4 сут, т.к. Р.myxofaciens может образовывать сероводород на 3-4-е сутки. Бактерии родов Morganellа и Providencia сероводорода не образуют.
Окрашивание по Граму (ГОСТ Р 51446-99)
Это окрашивание бактериальных клеток позволяет описать морфологию бактерии и классифицировать их на две группы на основании способности образовывать в условиях испытания фиолетовое окрашивание с кристаллическим фиолетовым. Это разделение является следствием различий в структуре клеточных стенок двух групп и коррелирует с другими основными различиями между этими группами.
Техника окрашивания. После фиксации на предметном стекле бактериальной пленки из 18-24-часовой культуры заливают пленку раствором кристаллического фиолетового и оставляют на одну минуту для протекания реакции. Стекло промывают несколько секунд водой. На стекло наносят на 1 мин раствор Люголя, а затем промывают этанолом (95%) не более 30 секунд до прекращения вымывания фиолетового красителя. Стекло промывают водой для удаления этанола и докрашивают препарат раствором фуксина в течение 1 мин, после чего снова промывают водой и высушивают.
Препарат просматривают под микроскопом, используя для этого светосильный объектив с масляной иммерсией. Бактериальные клетки, окрашенные в синий или фиолетовый цвет, относят к грамположительным (Грам+), окрашенные в цвета от темно-розового до красного - к грамотрицательным (Грам ―).
Задание:
Ознакомьтесь с перечисленными микробиологическими методами исследования.
Начертите микробиологические схемы определения каждой группы микроорганизмов в соответствии с ГОСТами, с указанием питательных сред, условий культивирования, характерных признаков роста, биохимических тестов, морфологических признаков.
Материалы: ГОСТ 10444.15, ГОСТ 30518, ГОСТ 10444.2, ГОСТ 29185, ГОСТ 28566, ГОСТ 10444.12, "МУ по контролю в рыбной продукции парагемолитических вибрионов - возбудителей пищевых токсикоинфекций", ГОСТ 30519, ГОСТ 28560, ГОСТ 10444.11.