Приготовление питательных сред

Для получения и поддержания культур вне организма (in vitro) необходимы особые субстраты - питательные среды, на которых микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы, поэтому их еще называют средами для культивирования.

Тщательное приготовление питательных сред - один из основных этапов микробиологического исследования, требующий особого внимания.

Для приготовления сред использовали дистиллированную воду или равноценную по качеству, то есть свободную от веществ, способных ингибировать или воздействовать на рост микроорганизмов в период испытания. Дистиллированная вода должна соответствовать требованиям ГОСТа 6709-72 «Вода дистиллированная».

Для приготовления растворов, реактивов, красок и индикаторов применяли:

• реактивы по ГОСТу 13867-68;

• вспомогательные реактивы и растворы по ГОСТу 4517-87;

• вспомогательные индикаторы по ГОСТу 4919.1-77.

Для приготовления питательных сред используют два способа:

• из отдельных сухих или жидких компонентов;

• из сухой готовой среды.

При использовании промышленных сухих питательных сред их готовят в соответствии с указаниями изготовителя на этикетке.

По истечении установленных сроков годности исходные компоненты и готовые среды не использовали.

С помощью рН-метра измеряют и корректируют рН таким образом, чтобы после стерилизации и охлаждения до 25°С значение рН среды отличалось от требуемого не более чем на 0,2 рН. Корректировку проводят с помощью раствора гидроокиси натрия (NaOH) или соляной кислоты (НС1).

Среды разливали в соответствующие емкости вручную или с помощью автоматических аппаратов.

Стерилизацию питательных сред и реактивов проводят различными способами, в том числе влажным паром и фильтрованием.

Каждую упаковку бутылей, пробирок или чашек Петри маркируют с указанием названия среды и даты приготовления.

Готовые питательные среды хранят, если нет специальных указаний, при комнатной температуре не более 3 суток и при температуре около 4°С не более 1 месяца.

Питательные среды расплавляют на кипящей водяной бане. Перед использованием питательную среду содержат в расплавленном состоянии на бане с терморегулятором при температуре (47±2)°С. Сохраняют расплавленную питательную среду не более 8 ч.

Для исследования часто используют свежеприготовленные среды. Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева, разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм, и предварительно асептически подсушивают.

Питательные среды и реактивы:

1. ВСА (Висмут-сульфит агар). 55 г среды растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, доводят до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, снова доводят до кипения в закрытой колбе, охлаждают при комнатной температуре до 50°С и разливают в стерильные чашки. Не автоклавируется.

2. Водный раствор кристаллического фиолетового (0,1 г/дм³). 0,01 г кристаллического фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и растворяют в дистиллированной воде. Раствор доливают до меткию

3. Забуференная пептотая вода. 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 9 г Na₂HPО₄ •12H₂O, 1,5 г КН₂РО₄ растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, доводят до кипения, устанавливают рН (чтобы после стерилизации был 7,0±0,1 при температуре 25°С), разливают по колбам. Режим стерилизации (121±1)°С 20 мин.

4. Капустный агар. 200 г измельченной свежей капусты добавляют в 1 дм³ водопроводной воды, доводят до кипения, кипятят в течение 10-14 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученный фильтрат разводят водой в 2 раза, добавляют к нему 20 г глюкозы, 10 г пептона, 10 г углекислого кальция, расплавляют в нем при нагревании 15-20 г агара. Устанавливают рН среды 7,0-7,4, разливают в стерильные колбы. Стерилизуют 20 мин при 120°С. Снова доводят до кипения в закрытой колбе, охлаждают при комнатной температуре до 50°С и разливают в стерильные чашки. Не автоклавируется.

5. Кесслер. Готовится по прописи на этикетке.

6. Лактоза ВP. Готовится по прописи на этикетке.

7. ЛПС (Лактозопептонный раствор). 1 г пептона, 0,5 г лактозы, 0,5 г хлористого натрия растворяют в 100 см³ дистиллированной воды, доводят до кипения, устанавливают рН 7,4-7,6, разливают в пробирки, флаконы, колбы или другую посуду. Стерилизуют при (121±1)°С в течение 20 мин.

8. МСА (молочно-солевой агар). К 1 дм³ расплавленного или охлажденного до 45-60°С рыбо- или мясопептонного агара, содержащего 65 г хлорида натрия (рН 7,2-7,4), добавляют асептически 100 см³ стерильного обезжиренного молока. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

9. МИС (молочно-ингибиторная среда). К 85 см³ расплавленного и охлаждённого до 50°С рыбопептонного агара, добавляют 15 см³ обезжиренного стерильного молока, 1,25 см³ водного раствора кристаллического фиолетового (0,1 г/дм³), 1 см³ раствора теллурита калия массовой концентрацией 20 г/дм³, 200 000 ЕД полимексина М сульфата. Среду не стерилизуют, разливают в стерильные чашки Петри и хранят при температуре (4±2)°С не более 10 суток.

10. Пептонная вода. Пептонную воду готовят аналогично ПСР без добавления хлористого натрия.

11. ПСР (пептонно-солевой раствор). В 1 дм³ дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлористого натрия и 1 г пептона при медленном нагревании. При необходимости полученный раствор фильтруют, устанавливают рН 7,0±0,1, разливают в колбы, пробирки или другую посуду, укупоривают, стерилизуют при (121±1)°С в течение 30 мин.

12. Раствор метиленовой синего. 10 г метиленового синего со 100 см³ 96%этилового спирта. Смесь ставят в термостат на 24 ч при 37°С, затем смесь фильтруют. Для приготовления рабочего раствора смешивают 5 см³ насыщенного раствора краски с 195 см³ дистиллированной воды.

13. РПА (рыбо-пептонный агар). Готовят по прописи на этикетке, устанавливают рН 7,0, фильтруют, разливают по флаконам. Режим стерилизации - (121±1)°С 20 мин.

14. Рыбопептонный бульон с глюкозой. К 1 дм³ рыбопептонного бульона перед стерилизацией добавляют 10 г глюкозы, устанавливают рН 7,0 - 7,2 и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.

15. РПБ (рыбопептонный бульон). Готовится по прописи на этикетке.

16. Сабуро. 40 г глюкозы, 10 г пептона, 18 г агара растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, подогревают до расплавления, охлаждают, устанавливают рН (чтобы после стерилизации был 6,5±0,1 при температуре 25°С), разливают в колбы. Режим стерилизации - (121±1)°С 15 мин. Есть готовая среда: на 250 см³ воды 12,5 г бульона Сабуро и 4,5 г агара.

17. Селенитовая среда. Готовят по прописи на этикетке. Не автоклавируется.

18. Солевой бульон. В 1 дм³ рыбо- или мясопептонного бульона растворяют 65 г хлорида натрия, фильтруют, устанавливают рН 7,0-7,2. Стерилизуют при температуре 121 °С 20 минут. Количество хлорида натрия можно увеличить до 90 г.

19. Среда Китт - Тароцци. Для приготовления среды Китт - Тароцци стерильные пробирки заполняют на 1,0 - 1,5 см кусочками рыбы и заливают приготовленным рыбо-пептонным бульоном с глюкозой и агаром. В 1 дм³ рыбо-пептоного бульона вносят 10 г глюкозы и 1,5 г агара, который при нагревании постепенно расплавляют (высота слоя бульона в обычных пробирках 12-13 см, в высоких 15-18 см) и стерилизуют 20 мин при температуре (121±1) °С. Требуемую величину рН проверяют до и после стерилизации, должно быть (7,1 ±0,1). При посевах в свежеприготовленную среду Китт - Тароцци (не более 3 сут с момента приготовления) добавлять агар, вазелиновое масло или наслаивать на ее поверхность голодный агар не обязательно.

20. Среда Плоскирева.. 55 г среды растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды , доводят до кипения, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, снова доводят до кипения в закрытой колбе, охлаждают при комнатной температуре до 50°С и разливают в стерильные чашки. Не автоклавируется.

21. Трехсахарный агар. Готовят по прописи на этикетке, разливают по 6-7 см³ в пробирки. Режим стерилизации - (121± 1 )°С 10 мин.

22. Физиологический раствор. 8,5 г хлорида натрия растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, фильтруют, устанавливают рН 7,0±0,1. стерилизуют при температуре 121 °С 20 мин.

23. Цитратная плазма кролика. Для реакции плазмокоагуляции препарат выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.

24. Щелочная полимиксиновая среда. Основа среды - к 400 см³ мясо-пептонного бульона по ГОСТ 10444.1 добавляют 5 г натрия хлорида, 10 г глюкозы, 10 см³ дрожжевого экстракта. Основу среды стерилизуют при 110°С в течение 12 минут, охлаждают и добавляют 250 см³ раствора натрия карбоната массовой концентрацией 21,2 г/дм³ и 250 см³ раствора бикарбоната натрия массовой концентрацией 10 г/дм³. Устанавливают рН таким образом, чтобы при 25°С он составлял (10,1±0,1). После этого к среде добавляют 200 000 ЕД полимиксина М сульфата, 5 см³ спиртового раствора бромтимолового синего. Среду хранят в защищенном от света и высыхания виде при (4±2)°С не более 7 суток. Непосредственно перед использованием среду разливают по 5 см³ в стерильные пробирки.

25. Щелочной агар. Готовится по прописи на этикетке.

26. Эндо. 40 г растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды, доводят до кипения, фильтруют через ватный тампон, снова доводят до кипения в закрытой колбе, охлаждают при комнатной температуре до 50°С и разливают в стерильные чашки. Не автоклавируется.

Приложение 7

Таблица Мак-Креди

Числовая характерис- тика тика	НВЧ при параллельном заражении пробирок в количестве				Числовая характерис- тика	НВЧ при параллельном заражении пробирок в количестве
	двух	трех	четы­рех	пяти		двух	трех	четы­рех	пяти
000 001 002 003 010 011 012 013 020 021 022 030 031 040 041 100 101 102 103 110 111 112 113 120 121 122 123 130 131 132 140 141 200 201 202 203 210 211 212 213 220 221 222 223 230 231 232	0,0 0,5 — — 0,5 0,09 — — 0,9 — — — — — — 0,6 1,2 — — 1,3 2,0 — — 2,0 3,0 — — — — — — — 2,5 5,0 — — 6,0 13,0 20,0 — 25,0 70,0 110,0 — — — —	0,0 0,3 — — 0,3 0,6 — — 0,6 — — — — — — 0,4 0,7 1,1 — 0,7 1,1 — — 1,1 1,5 — — 1,6 — — — — 0,9 1,4 2,0 — 1,5 2,0 3,0 — 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0	0,0 0,2 0,5 0,7 0,2 0,5 0,7 0,9 0,5 0,7 0,9 0,7 0,9 0,9 1,2 0,3 0,5 0,8 1,0 0,5 0,8 1,1 1,3 0,8 1,1 1,3 1,6 1,1 1,4 1,6 1,4 1,7 0,6 0,9 1,2 1,6 0,9 1,3 1,6 2,0 1,3 1,6 2,0 — 1,7 2,0 —	0,0 0,2 0,4 — 0,2 0,4 0,6 — 0,4 0,6 0,6 — — — — 0,2 0,4 0,6 0,8 0,4 0,6 0,8 — 0,6 0,8 1,0 — 0,8 1,0 — 1,1 — 0,5 0,7 0,9 1,2 0,7 0,9 1,2 — 0,9 1,2 1,4 — 1,2 1,4 —	240 241 300 301 302 303 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 340 341 350 400 401 402 403 410 411 412 413 414 420 421 422 423 424 430 431 432 433 434 440 441 442 443 444 450	— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —	— — 2,5 4,0 6,5 — 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 65,0 110,0 140,0 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —	2,0 3,0 1,1 1,6 2,0 2,5 1,6 2,0 3,0 3,5 2,0 3,0 3,5 — 3,0 3,5 4,0 5,0 3,5 4,5 — 2,5 3,5 5,0 7,0 3,5 5,5 8,0 11,0 14,0 6,0 9,5 13,0 17,0 20,0 11,5 16,5 20,0 30,0 35,0 25,0 40,0 70,0 140,0 160,0 —	1,4 — 0,8 1,1 1,4 — 1,1 1,4 1,7 2,0 1,4 1,7 2,0 — 1,7 2,0 — — 2,0 2,5 2,5 1,3 1,7 2,0 2,5 1,7 2,0 2,5 — — 2,0 2,5 3,0 — — 2,5 3,0 4,0 — — 3,5 4,0 — — — 4,0

Числовая характерис- тика	НВЧ при параллельном заражении пробирок в количестве				Числовая характерис- тика	НВЧ при параллельном заражении пробирок в количестве
	двух	трех	четырех	пяти		двух	трех	четырех	пяти
451 500 501 502 503 504 510 511 512 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 552 553 554 555	— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —	— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —	— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —	5 2,5 3,0 4,0 6,0 7,5 3,5 4,5 6,0 8,5 5,0 7,0 9,5 12,0 15,0 17,5 8,0 11,0 14,0 17,5 20,0 25,0 13,0 17,0 25,0 30,0 35,0 45,0 25,0 35,0 60,0 90,0 100,0 180,0

Приложение 8