Контрольные вопросы

1. В каких документах представлены нормативы по степени опасности почвы в санитарно-эпидемическим отношении?

2. С какой целью проводится гигиеническая оценка почв?

3. Какие санитарно-показательные микроорганизмы вы знаете, каково их санитарное значение?

4. Что такое индекс и титр?

5. Расскажите о значении биологической активности почвы и методах её определения.

Лабораторная работа №12 Определение наиболее вероятного числа (нвч) микроорганизмов по методу предельных разведений

Наиболее вероятным числом микроорганизмов называют число организмов на единицу объема, определенное методом разведений, которое в соответствии с теорией статистики будет наиболее до­стоверным и ближе всего к истинному числу, чем лю­бое другое число, полученное при анализе результатов посева.

Метод предельных разведении менее точен, чем метод подсчета колоний на чашках Петри, однако он дает лучшие результаты при учете микроорганизмов, плохо paстущих на плотных питательных средах. Метод предельных разведений используют для определения числа газообразующих бактерий, облигатных анаэробов и некоторых других микроорганизмов. При работе по этому методу первостепенное значение имеет точность приготовления разведений и стерильность используемой посуды, поскольку каждая бактериальная клетка может повысить искомый показатель сразу в 10 раз.

При использовании метода предельных разведении готовят ряд последовательных десятикратных разведений. Посевной материал из приготовленных разведений засевают в строго опреде­ленное для данного опыта число пробирок с питательной средой.

После инкубации в пробирках, появятся признаки роста.

В пробирках, засеянных материалом, разведенным до малых концентраций, рост микроорганизмов не наблюдается. Доля пробирок, в которых обнаружен рост, зависит от концентрации живых микроорганизмов в исследуемом материале.

Для подсчета наиболее вероятного числа живых мик­роорганизмов по методу предельных разведении Мак-Креди на основании закономерностей вариационной ста­тистики разработал таблицы для учета результатов (см. приложение 7).

При пользовании этой таблицей по числу пробирок, в которых обнаружен рост микроорганизмов, составляют числовую характеристику, выраженную тре­мя цифрами. На первом месте (слева) указывают число засеянных пробирок из последнего разведения, давшего во всех пробирках рост. Вторая и третья цифры число­вой характеристики соответствуют числу пробирок с признаками роста из двух последующих разведений.

Пример. Допустим, что при проведении анализа методом пре­дельных разведении при засеве двух параллельных пробирок получе­ны следующие результаты:

Разведение 0 1·10^-1 1·10^-2 1·10^-3 1·10^-4 1·10^-5

Число пробирок

засеянных 2 2 2 2 2 2

с признаками роста 2 2 2 1 0 0

Последним разведением, давшим рост во всех засеянных пробир­ках, является разведение 1·10^-2. Следовательно, первым в числовой характеристике будет число 2. Следующие две цифры числовой ха­рактеристики 1 и 0. Числовая характеристика для нашего примера равняется 210. По табл. находим наиболее вероятное число, со­ответствующее числовой характеристике 210 при двух засеянных про­бирках. Это число - 6,0. Поскольку за начальное число числовой ха­рактеристики принято разведение 1·10^-2 (1/100), то искомое число равняется произведению наиболее вероятного числа 6,0 на это раз­ведение, взятое с обратным знаком. Следовательно, наиболее вероят­ное количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (или 1 см³) изучаемого объекта, есть 600. Если окажется, что после последнего разведения, использован­ного для составления числовой характеристики, последующие раз­ведения также дали рост, то последнюю цифру числовой характери­стики увеличивают на единицу. Предположим, что в нашем примере пробирка, засеянная из разведения 1·10^-5, проросла:

разведение 0 1·10^-1 1·10^-2 1·10^-3 1·10^-4 1·10^-5

Число пробирок

засеянных 2 2 2 2 2 2

с признаками роста 2 2 2 1 0 1

В этом случае числовая характеристика равняется 211 и наибо­лее вероятное число -13. Откуда наиболее вероятное количество живых микроорганизмов в 1 см³ исследуемого продукта составит 1300.

Задание: определить НВЧ спорообразующих анаэробов в 1 г почвы методом предельных разведений.

Материалы и оборудование: пробы почвы с детских площадок, рекреационных зон, спиртовки, петли, чашки Петри, пробирки, предметные стекла, микроскоп, термостат, питательные среды: питательная среда Китт-Тароцци, уплотнённый питательный агар.

Ход работы:

1. Приготовить питательные среды, посуду для микробиологических исследований (см. приложение 6).

2. Отобрать пробы почвы (см. лабораторную работу 11).

3. Приготовить десятикратные разведения (см. лабораторную работу 11).

4. Из каждого разведения отобрать по 1 см³ в две пробирки со средой Китта-Тароцци. Посевы прогреть при температуре 80⁰С, в течение 20 мин в водяной бане, охладить.

5. Посевы поместить в термостат на (44±1)⁰С на 16-18 ч, о присутствии споровых анаэробных микроорганизмов судят по наличию помутнения и газообразования.

6. Составить предварительную числовую характеристику.

7. Подтвердить присутствие анаэробов пересевом в уплотнённый агар (метод глубинного посева) под стекло. Для этого 0,5-1 см³ из каждой пробирки с признаками роста перенести в чашку Петри, залить предварительно расплавленным и охлаждённым до (45-50⁰С) РПА уплотненным, после застывания агара, положить на него предметное стекло, так чтобы под ним не было пузырьков воздуха. Посевы культивировать при (44±1)⁰С 16-18 ч. Рост микроорганизмов под стеклом (в анаэробных условиях) подтверждает присутствие строгих анаэробов.

8. Составить окончательную числовую характеристику.

9. По таблице Мак-Креди (приложение 7) определить количество споровых анаэробов в 1 г почвы.