Корнюшкина Алина
Вопрос.25
Изготовили несколько мазков: мазок – отпечаток из пораженной ткани, мазок из агаровой культуры стафилококка, мазок из бульонной культуры стрептококка , мазок из агаровой культуры клебсиелл , мазок из гноя.
Какие мазки нужно зафиксировать химическим методом?
Какие фиксаторы можно использовать?
Ответ.
Мазок отпечаток из пораженной ткани. Этот препарат фиксируется спиртом, промывается осторожно проточной водой, высушивается, окрашивается и микроскопируется.
В мазках из агаровой культур рекомендуется фиксировать метиловым спиртом.
(Мазок из бульонной культуры стрептококка фиксируют на пламени, проводя 3-4 раза тыльной стороной стекла (мазком вверх) через пламя горелки. При фиксации микроорганизмы погибают и прикрепляются к стеклу. Мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.)
(Мазок из гноя фиксируют над пламенем .)
Для фиксации мазков химическим способом применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40 % формалин 5 мл, этиловый спирт 96° — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе,
Корнюшкина Алина
Вопрос.26
Алгоритм изготовления простых питательных сред (МПБ,МПА).
При каких условиях стерилизуют МПА и МПБ?
Подготовка посуды, в которую разливают питательные среды.
Ответ.
Приготовление мясо — пептонного бульона (МПБ)
Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холодной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. Затем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего остужают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут.
Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлорида натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра. (гидроксид натрия)
Приготовление мясо — пептонного агара (МПА)
К 1л мясной воды прибавляют 1г пептона и 0,5г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный таким образом бульон фильтруют, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2-7,4) и добавляют 0,2-2г измельченного агар-агара (в зависимости от качества агар-агара и назначения среды). После добавления агар-агара жидкость кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. При помутнении среды ее просветляют.
МПБ стерилизуют 15-20 минут при температуре +1200С. Если после стерилизации в бульоне выпадает осадок, его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичная стерилизация производится при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвращения выпадения осадка.
МПА стерилизуют в автоклаве при температуре +1200С в течение 20 минут.
Приготовление посуды.
Посуду перед употреблением нужно прокипятить с кислотой, для этого ее помешают в эмалированное ведро и заливают горячей водой с добавлением 15—20 мл крепкой серной кислоты. Посуду кипятят в течение, после чего тщательно моют и сушат. Помимо мойки, вся посуда, употребляемая для микробиологической работы, должна быть простерилизованна паром под давлением в автоклаве. Чистые высушенные чашки Петри завертывают по две в оберточную бумагу и затем стерилизуют. Пастеровские пипетки завертывают в один пакет по 4—5 пипеток, также отмечая верхний конец. Пробирки, бутылки и колбы перед стерилизацией закрывают ватными пробками из не обезжиренной ваты. Питательные среды разливают в стерилизованную посуду и стерилизуют в автоклаве, Для этого после розлива питательной среды горлышки бутылок и колб завертывают плотной бумагой и завязывают.
Корнюшкина Алина
Вопрос 27.
Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.
По каким признакам характеризуют колонии микроорганизмов?
Охарактеризуйте бактериальную колонию на пластинчатом агаре и пересейте ее на скошенный агар.
Ответ.
На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения, либо осадка.
На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста многих микроорганизмов на плотном субстрате.
При описании колонии учитывают следующие признаки :
форму колонии — округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т. д.
размер (диаметр) колонии измеряют в миллиметрах .
поверхность колонии — гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
профиль колонии — плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д.
блеск и прозрачность — колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;
цвет колонии — бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная — белая, желтая, золотистая.
В правой руке, держат петлю, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку держат между большим
и указательным пальцами левой руки так, чтобы ее основание находилось на поверхности кисти. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец.
Пробку вынимают над пламенем горелки, после чего обжигают ее края. Затем вводят петлю с материалом для посева в пробирку до дна и делают посев или на поверхность питательной среды.
Пересев культуры из одной пробирки в другую осуществляется аналогично. Только в левую руку берут сразу две пробирки, а затем правой рукой (мизинцем и безымянным пальцем) вынимают сразу две пробки. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37 °С.
Корнюшкина Алина
Вопрос 28
Больной, который работает на животноводческой ферме , обратился к врачу с жалобами на плохое самочувствие. Болеет примерно месяц. Учитывая специфичность роботы больного и соответствующие клинические симптомы, врач заподозрил у него бруцеллез.
А)какой материал используют для серологической диагностики бруцеллеза?
Б)на чем основывается серологический метод диагностики?
В)какие реакции можно использовать для серологической диагностики бруцеллеза?
Г)поставьте реакцию Хеддлсона для ускоренной диагностики бруцеллеза.
Отвт.
А)Используют материал кровь, моча, грудное молоко, аспираты костного мозга и биопсийный материал печени.
Б) Серологические реакции основываются на обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
В) Серологические методы включают реакции Хеддельсона, Райта, Кумбса, связывания комплемента (РСК), пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА), реакция иммуноферментного анализа (РИФА), иммунофлюоресценции.
Г) Для постановки реакции Хеддлсона берут из пальца около 1 мл крови, отстоявшаяся сыворотка должна быть совершенно прозрачной. Приготавливают пластинку оконного стекла, тщательно обезжиренную спиртом и разграфленную на 6 квадратов. Сыворотку крови больного наливают при помощи градуированной пипетки в центр каждого квадрата в следующих количествах: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 мл. К каждой из этих сывороток добавляют по одной капле антигена Хеддлсона (убитая культура бруцелл, подкрашенная метиленовым синим). Затем сыворотку, начиная с минимальных доз, смешивают с антигеном стеклянной палочкой. Контроль агглютинирующих, свойств сыворотки ставят в пятом квадрате (0,03 мл сыворотки и 0,03 мл изотонического раствора хлорида натрия), а контроль антигена — в шестом квадрате (0,03 мл антигена и 0,03 мл изотонического раствора хлорида натрия). Далее стекло равномерно подогревают в течение 2 мин. над пламенем спиртовки. Если реакция положительна, то уже через 6—8 мин. в каплях сыворотки, к которым был добавлен диагностикум, появляются хлопья, окрашенные в синий цвет.
Корнюшкина Алина