17. Бактеріологічний метод дослідження. Принципи, методи та етапи виділення чистих культур бактерій та їх ідентифікації.

Бактеріологічний метод дослідження є найважливішим у практичній діяльності будь-якої мікробіологічної лабораторії. Від правильного його виконання залежить визначення етіологічного чинника, що викликав захворювання, і, відповідно, вибір тактики лікування інфекційного хворого. Важливість цього методу пояснюється тим, що в багатьох випадках лікарі мають справу з мікробними асоціаціями, тоді необхідно встановлювати роль кожного з мікробів у виникненні хвороби.

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, полягає в проведенні послідовних серійних розведень матеріалу, який містить мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо клопіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

Цього недоліку не має метод Коха (метод пластинчастих розведень). Р. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на стерильні скляні пластини. Після застигання середовища воно культивувалось при оптимальній температурі. У його товщі утворювались ізольовані колонії мікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод Дригальського. Спочатку на поверхню середовища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За допомогою металевого або скляного шпателя його ретельно втирають у середовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб рівномірно розподілити матеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі - в третій. Тільки після цього шпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На поверхні середовища в першій чашці спостерігаємо, як правило, суцільний ріст бактерій, у другій - густий ріст, а в третій - ріст у вигляді ізольованих колоній.

Метод штрихових посівів. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу і проводять посів його паралельними штрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів.

Для одержання ізольованих колоній можна використати посів тампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні: 1. За типом дихання. 2. За спороутворенням. 3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. 4. Рухомість бактерій.5. Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших протимікробних засобів. 6. Введення деяких антибіотиків 7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні покриви. 8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворювань.

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями як штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом розуміють мікроби одного виду, які виділено з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій - це мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забирають патологічний матеріал. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом та іншим ознаками, готують мазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватномарлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу - одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

На другий день (II етап дослідження) на поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія - це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер краї’в і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вивчення морфологічних та тинкторіальних властивостей збудників, досліджують рухомість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

У разі потреби виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного живильного середовища для одержання ізольованих колоній.

На третій день (III етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звергають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони досить різноманітні. Найчастіше досліджують цукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринопізину, перетворення нітратів у нітрити тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.

На четвертий день (IV етап дослідження). На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію.