- •Введение 6
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Характеристика энтомопатогенного гриба Verticillium lecanii
- •1.2 Характеристика отряда Homoptera (равнокрылые)
- •1.2.1 Семейство Aleyrodinea – белокрылки
- •1.3 Инфицирование и развитие микозов
- •1.4 Изучение процесса патогенеза с помощью электронной
- •1.5 Факторы, влияющие на процесс патогенеза
- •1.6 Влияние ультрафиолетового облучения
- •1.7 Разработка препаративных форм биоинсектицидов на основе спор энтомопатогенных грибов
- •2 Цели и задачи исследования
- •3 Экспериментальная часть
- •3.1 Объекты исследования
- •3.1.1 Культура гриба Verticillium lecanii
- •3.2 Материалы и методы
- •3.2.1 Питательные среды
- •3.2.2 Культивирование гриба Verticillium lecanii
- •3.2.3 Определение титра спор
- •3.2.4 Получение образца биопрепарата гриба
- •Verticillium lecanii на ферментационной установке
- •3.2.5 Получение препаративных форм
- •3.2.6 Определение жизнеспособности спор гриба
- •3.2.7 Определение вирулентности препаративных
- •3.2.8 Определение вирулентности препаративных
- •3.2.9 Определение биологической эффективности
- •3.2.10 Изучение процесса патогенеза с помощью
- •3.2.11 Изучение влияния уф-излучения на
- •3.2.12 Изучение влияния уф-облучения на
- •3.3 Статистическая обработка результатов
- •4 Результаты исследований и их обсуждение
- •4.1 Результаты оценки влияния добавок к препаративным формам на жизнеспособность спор гриба Verticillium lecanii
- •4.2 Результаты опыта по изучению биологической
- •4.3 Результаты оценки влияния уф-излучения
- •4.4 Результаты опыта по изучению влияния уф-облучения
- •4.5 Результаты опыта по изучению процесса патогенеза с помощью электронной сканирующей и световой микроскопии
- •5 Выводы
- •Технико-экономическая оценка результатов исследования
- •Б.2 Расчет затрат на проведение исследовательской работы
- •В.3.2 Основные правила безопасности работы в лаборатории При работе с едкими веществами:
3.2.9 Определение биологической эффективности
образца биопрепарата в производственных опытах
В производственных условиях биологическую эффективность образца биопрепарата ЛПФ оценивали на огурцах в тепличном комбинате ЗАО «Весна» (г.Тихвин, Ленинградской области). Обработку производили пастой, полученной на ферментационной установке ЗАО «Агробиотехнология» г. Москва. Навеску 200 г пасты растворяли в 10л воды, добавляли 1 мл Твина-80 и обрабатывали растения, предварительно подсчитав количество особей белокрылки. Через неделю после обработки вели повторный учет численности белокрылки и рассчитывали биологическую эффективность.
3.2.10 Изучение процесса патогенеза с помощью
электронной сканирующей и световой микроскопии
Для изучения процесса патогенеза с помощью микроскопических методов использовались личинки белокрылки 2-3 возраста на фасоли, выращеной гидропонно. Далее проводили обработку биопрепаратом. Навеску в 0,5 г биопрепарата (ЛПФ) и спор без добавок разводили в таком количестве воды, чтобы обеспечить титр спор 5×106 спор/мл. Полученной суспензией обрабатывали листья фасоли, находящиеся на чашках Петри, накрывали полиэтиленовой пленкой с небольшими отверстиями для аэрации. Через каждые 24 часа в течение 5 суток на поверхности листьев вырезались диски диаметром 10 мм с зараженной белокрылкой. Диски помещались в фиксатор Карнуа (этанол: хлороформ: ледяная уксусная кислота – 6: 3: 1) на 2 часа для экстракции хлорофилла, а затем хранились в 70%-ном этиловом спирте, при температуре -15 оС [1]. Эти диски были рассмотрены под электронным сканирующим микроскопом с марки Evo E40, Carl Zeiss, Германия.
Для световой микроскопии диски окрашивали анилиновым синим, выдерживая в красителе в течение часа. Для того, чтобы уменьшить угол преломления света в микроскопе, препараты помещали в глицерин-желатиновую смесь (на 100 г смеси: 42 мл дистиллированной воды, 7 г желатина, 50 г глицерина, 1 г фенола). Рассматривали их под световым микроскопом с 200 – 400-ным увеличением марки MTB 2004, Carl Zeiss, Германия, обрабатывали изображения с помощью программы Axio Vision 4.6 (Carl Zeiss, Германия).
3.2.11 Изучение влияния уф-излучения на
жизнеспособность спор гриба Verticillium lecanii
Влияние УФ-излучения на жизнеспособность спор гриба изучали на образцах пасты ЛПФ и спорах без добавок. Споровую суспензию с титром спор 5×106 спор/мл наносили в виде капелек диаметром 5 мм на поверхность чашек Петри с агаризованной средой Чапека с ограничителем роста Тритоном Х-100 (0,01%), подсушенных в течение 2 суток. Облучение проводили с помощью УФ-ламп. Первая лампа с энергетической освещенностью 93,8 Вт/м2, длиной волны (300-360) нм и вторая лампа УФО-03-250 Н-Электроника с энергетической освещенностью 15200 Вт/м2 и длиной волны (280-400) нм. В качестве стандартного УФ-протектора использовали диоксид титана, который вносили в количестве 5% от общего объёма суспензии. В качестве новых УФ-протекторов были испытаны активированный уголь и каолин (5% от общего объёма суспензии). Открытые чашки с нанесенной капельками споровой суспензией помещали под лампы. Под первой лампой оставляли на 10 минут, а под второй – на 1 минуту. По истечении необходимого времени чашки закрывали и помещали в термостат при 27 оС, туда же помещались чашки без облучения. Через 24 часа вели подсчет проросших и непроросших спор под микроскопом при увеличении в 10 раз в пяти полях зрения. Затем чашки снова помещали в термостат на 5 суток для контроля прорастания. Определяли прорастания как отношение числа проросших спор к общему количеству спор в поле зрения [31].