- •Введение 6
- •1 Аналитический обзор
- •1.1 Характеристика энтомопатогенного гриба Verticillium lecanii
- •1.2 Характеристика отряда Homoptera (равнокрылые)
- •1.2.1 Семейство Aleyrodinea – белокрылки
- •1.3 Инфицирование и развитие микозов
- •1.4 Изучение процесса патогенеза с помощью электронной
- •1.5 Факторы, влияющие на процесс патогенеза
- •1.6 Влияние ультрафиолетового облучения
- •1.7 Разработка препаративных форм биоинсектицидов на основе спор энтомопатогенных грибов
- •2 Цели и задачи исследования
- •3 Экспериментальная часть
- •3.1 Объекты исследования
- •3.1.1 Культура гриба Verticillium lecanii
- •3.2 Материалы и методы
- •3.2.1 Питательные среды
- •3.2.2 Культивирование гриба Verticillium lecanii
- •3.2.3 Определение титра спор
- •3.2.4 Получение образца биопрепарата гриба
- •Verticillium lecanii на ферментационной установке
- •3.2.5 Получение препаративных форм
- •3.2.6 Определение жизнеспособности спор гриба
- •3.2.7 Определение вирулентности препаративных
- •3.2.8 Определение вирулентности препаративных
- •3.2.9 Определение биологической эффективности
- •3.2.10 Изучение процесса патогенеза с помощью
- •3.2.11 Изучение влияния уф-излучения на
- •3.2.12 Изучение влияния уф-облучения на
- •3.3 Статистическая обработка результатов
- •4 Результаты исследований и их обсуждение
- •4.1 Результаты оценки влияния добавок к препаративным формам на жизнеспособность спор гриба Verticillium lecanii
- •4.2 Результаты опыта по изучению биологической
- •4.3 Результаты оценки влияния уф-излучения
- •4.4 Результаты опыта по изучению влияния уф-облучения
- •4.5 Результаты опыта по изучению процесса патогенеза с помощью электронной сканирующей и световой микроскопии
- •5 Выводы
- •Технико-экономическая оценка результатов исследования
- •Б.2 Расчет затрат на проведение исследовательской работы
- •В.3.2 Основные правила безопасности работы в лаборатории При работе с едкими веществами:
3.2.6 Определение жизнеспособности спор гриба
в образцах препаративных форм
Жизнеспособность спор гриба определяли путем высева с помощью метода Коха [27]. Навеску 1 г каждой препаративной формы растворяли в воде и делали ряд последовательных разведений в стерильной воде до разведения 106. Полученные суспензии высевали на чашки Петри с 1%-ным агаром по 0,1 мл в трех повторностях для каждого варианта пасты. Выращивали в течение 7 суток при температуре 27оС. На 7-е сутки осуществляли подсчет колоний на чашках. Расчет титра жизнеспособных спор представлен в формуле 2.Опыт производили через неделю, две недели, месяц и два месяца после изготовления препаративных форм.
Т=Х×10n+1, |
(2) |
где Т – титр спор препарата;
Х – среднее количество колоний на чашке;
n – номер разведения.
3.2.7 Определение вирулентности препаративных
форм в лабораторных опытах
С этой целью получали популяцию белокрылки одного возраста. В качестве кормового растения использовалась фасоль, выращенная гидропонно. Бобы фасоли замачивали на сутки в воде, затем оставляли на неделю, накрыв мокрой тканью. Фасоль, на которой появились ростки, помещали на банку с водой, накрытую марлей. Ёще через неделю, когда на фасоли появлялись листья, её заражали белокрылкой. Белокрылка из инсектария ВИЗР поддерживается постоянно на табаке. Фасоль оставляли на 2 дня рядом с табаком для откладки яиц, после чего имаго сдували. После того как появлялись личинки 2 возраста (в среднем через 2 недели), листья аккуратно отрезали и помешали на влажную вату в чашку Петри. Белокрылка преимущественно заселяет нижнюю сторону листа, поэтому эта сторона использовалась для учета живых личинок до и после обработки. Далее проводили обработку биопрепаратом. Навеску в 0,5 г биопрепарата (ЛПФ) и спор без добавок разводили водой до титра спор 5×106 спор/мл. Полученной суспензией обрабатывали листья фасоли, находящиеся на чашках Петри и накрывали полиэтиленовой пленкой с небольшими отверстиями для аэрации. Учеты живых личинок проводили до обработки, на 4 и 7 сутки [29]. Расчет биологической эффективности представлен в формуле 3:
Э =(1 – N/N’)×100 %, (3)
где N – количество особей белокрылки после обработки;
N’– количество особей белокрылки до обработки.
3.2.8 Определение вирулентности препаративных
форм в вегетационных опытах
Определяли вирулентность препаративных форм с помощью обработки огурцов суспензией препаративных форм с титром 1×107 спор/мл. На листья огурцов, выращенных в теплице ВИЗР, подсаживали имаго оранжерейной белокрылки для откладки яиц. Через 3 недели подсчитывали количество личинок и имаго белокрылки на учетных листьях. Далее растения обрабатывали суспензией препаративных форм. Так как споры гриба гидрофобны, то для их лучшей адгезии на поверхности кутикулы насекомых добавляли эмульгатор Твин-80 (0,01%). Подсчет личинок и имаго осуществляли через 7 суток, 14 суток и 4 недели после обработки [30]. При этом листья хранились под стеклянными колпаками и стояли в колбах с водой, чтобы поддерживалась влажность необходимая для развития гриба. Рассчитывали вирулентность препаративных форм (формула 3).