Інструкція до проведення практичного заняття №3

Тема: Серологічні реакція

Оснащення:	- Аглютиноскоп; - Діагностичні та імунні сироватки; - Культура кишкової палички; - 0,9% розчин NaCl; - Бактеріальні петлі; - Спиртівки, спирт, сірники; - Предметні скельця, пробірки, піпетки; - Дезінфекційний розчин; - Мило, рушник.
Конкретні цілі:
Знати:	Вчення про імунітет. Структуру імунної системи організму людини. Основні механізми формування імунної відповіді. Серологічні реакції, їх застосування. Експрес-методи діагностики: реакції імунофлюоресценції, імуноферментного та радіоімунного аналізу.
Вміти:	Проводити реакцію аглютинації на склі, облік та оцінювання результатів.
Практичні навички:	1. Проведення реакції аглютинації. 2. Пояснення методів оцінювання імунного статусу організму людини. 3. Розуміння суті експрес-методів діагностики інфекційних хвороб. 4. Дотримання вимог охорони праці, техніки безпеки, протиепідемічного режиму, чинних наказів МОЗ України під час роботи з біологічним матеріалом.

Хід заняття:

1. Познайомтеся з принципом і практичним застосуванням серологічних реакцій.

Запишіть у щоденник Інструкцію по проведенню серологічних реакцій.

В імунному захисті організму від чужорідних агентів важливу роль відіграють імунологічні реакції, які здійснюються антитілами або імунокомпетентними клітинами. Реакція здійснюється за рахунок зв’язку між антигеном та антитілом.

Проте реакція антигенів з антитілами можуть відбуватись і в пробірках у присутності електроліту.

Реакція між антигеном і антитілом відбувається у 2 фази:

 перша специфічна – утворення комплексу Ar + Aт;

 друга – утворення макроагрегатів.

Реакція антиген-антитіло in vitro супроводжується виникненням декількох феноменів – аглютинації, преципітації, лізису. Аглютинація і преципітація характеризується утворенням видимих агрегатів внаслідок об’єднання багатьох комплексів. Лізис зумовлений зв’язуванням комплементу комплексом Ar + Aт.

Антитіла, що беруть участь у реакції, відповідно до кожного феномену, називають аглютинінами, преципітинами, лізинами.

Усі серологічні реакції використовують з двоякою метою:

 для виявлення антитіл у сироватці хворого – для серологічної діагностики інфекційної хвороби;

 для визначення невідомих антигенів (бактерій, рикетсій, грибів, вірусів) – для серологічної ідентифікації збудників.

При цьому невідомий компонент визначають за відомим.

Наприклад, якщо сироватка крові реагує з конкретним мікробом антигеном, це означає, що в сироватці крові є антитіла проти даного мікроорганізму, отже саме він є збудником даного інфекційного захворювання. Вид збудника визначають за допомогою відомої імунної сироватки.

Для серодіагностики беруть відомі антигени (діагностикуми) – суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині; для ідентифікації – імунні сироватки, які отримують шляхом імунізації тварин відповідними бактеріальними або вірусними антигенами. При одержанні такої сироватки визначають її титр – найбільше розведення, у якому ще проявляється реакція з відповідним антигеном.

Найчастіше використовують реакції аглютинації і реакцію непрямої гемаглютинації.

Реакцію аглютинації можна ставити на склі і розгорнуту – у пробірках.

2. Під керівництвом викладача поставте РА на склі, для чого на предметне скло нанесіть одну краплю відповідної імунної сироватки (опит) і одну краплю ізотонічного розчину (контроль). В обидві краплини по черзі внесіть невелику кількість досліджувальної культури, проемульгуйте. Після кожного використання петлі, простерилізуйте її у полум’ї спиртівки. Почекайте 2-3 хвилини і проведіть облік результату.

УВАГА! Якщо у контролі аглютинація відсутня, а в опиті утворилися хлоп’я, - це свідчить про позитивний результат. Якщо аглютинація відсутня у обох краплинах, - негативний результат.

3. Ознайомтесь з методами оцінювання імунного статусу людини, запишіть у щоденник «Дослідження імунного статусу».

Постійність імунологічного нагляду організму здійснюється за рахунок балансу між різними рівнями активності компонентів імунної системи. Але при різних патологічних станах показники імунітету можуть відхилятися від нормальних величин, що має як діагностичне, так і прогностичне значення й часто вимагає імунокорекції (медикаментозного втручання). Тому вивчення стану окремих даних ланки імунної системи має велике значення.

Оцінку імунологічного статусу проводять при необхідності детального обстеження стану здоров’я, імунодефіцитних і алергічних станах, трансплантації органів і тканин, онкологічних та інших захворюваннях.

ВООЗ рекомендує двоетапний принцип обстеження.

На першому етапі виявляють загальні характерні або грубі дефекти гуморального і клітинного імунітету за допомогою простих загальнодоступних орієнтовних тестів.

Більш детальний аналіз імунологічного статусу проводиться на другому етапі, якщо виявлені відхилення в результатах тестів або при наявності спеціальних показань.

На основі одержаних даних можна достовірно оцінити стан імунної системи організму й застосувати конкретні підходи для корекції.

Орієнтовні показники імунного статусу людини

№ п/п	Показники		Норма
1	Абсолютне число лейкоцитів (109/л)		4 - 8
2	Абсолютне число лімфоцитів (109/л)		0,8 – 3,6
3	Лімфоцити (%)		18 - 38
4	Нейтрофіли (%)		50 - 77
5	Фагоцитарний індекс (%)		50 - 70
6	Бактерицидна активність сироватки (%)		3 - 9
7	Титр комплементу		0,02 – 0,08
8	Концентрація:	Ід G (г/л)	8,0 - 12
		Ід М (г/л)	8,0 - 15
		Ід А (г/л)	1,4 – 2,0
		Ід Е (г/л)	0,0002
9	Т-хелпери (%)		30 - 40
10	Т-супресори (%)		15 - 20
11	Т-лімфоцити (%)		40 – 60
12	В-лімфоцити (%)		15 - 30

4. Ознайомтесь з принципом і застосуванням реакцій для експрес-діагностики інфекційних хвороб.

Реакція імунофлюоресценції (РІФ)	Використовують для виявлення антигену за допомогою антитіл, які помічені флуорохромом (барвником, який світиться під дією ультрафіолетових променів, що можна спостерігати в люмінесцентному мікроскопі). Антигени можна виявляти у патологічному матеріалі, не виділяючи чисту культуру збудника (збудник черевного тифу у фекаліях, збудник сибірки в уражених тканинах).
Реакція імуноферментного аналізу (ІФА)	При ІФА відбувається взаємодія антигену з антитілом, яке хімічно пов’язане з ферментом пероксидазою хріну або фосфатазою. Утворений комплекс антиген-антитіло виявляє ферментативну активність і розщепляє відповідний субстрат, що супроводжується зміною забарвлення. Інтенсивність забарвлення залежить від кількості антитіл або антигенів у сироватці крові.
Радіоімунний метод	За своїм механізмом відрізняється від попередніх тим, що замість ферментів для мітки антиглобулінової сироватки використовують радіоактивні ізотопи. Кількість антитіл визначають за інтенсивністю радіоактивного випромінювання, що реєструється спеціальними лічильниками.
За допомогою імуноферментного (ІФА) і радіоімунного методів діагностують вірусні гепатити, СНІД, виявляють ракові антигени, вивчають антигенну структуру мікроорганізмів, тощо.

5. Проведіть дезінфекцію робочого місця, рук.

6. Оформіть щоденник, зробіть висновки.

Література до практики:

Люта В.А., Кононов О.В. «Практикум з мікробіології», стор. 67 – 75.