Лабораторна робота № 9 Спектрофотометричний метод визначення концентрації білка, який ґрунтується на здатності поглинати ультрафіолетове світло

Потрібно знати:

1) види випромінювань (рентгенівське, ультрафіолетове, видиме, інфрачервоне) та властивості кожного з них;

2) структурні формули амінокислот, здатних поглинати ультрафіолетове світло; при­клади білків, у яких переважають ці амінокислоти, та їх роль в організмі;

3) переваги і недоліки спектрофотометричного методу визначення концентрації білка;

4) роль ароматичних амінокислот в утворенні вторинних метаболітів, гормонів та нейромедіаторів.

Потрібно вміти:

1) визначати приблизну оптичну густину розчину при пропусканні світла із заданою довжиною хвилі, якщо відомий спектр поглинання світла даним розчином.

Суть спектрофотометричних методів визначення вмісту білка в розчині полягає в тому, що оптична густина розчину в певних зонах ультрафіолетової частини спектру (а для ряду білків – і у видимій) у певних межах лінійно пов’язана з концентрацією білка. У видимому діапазоні спектру здатність поглинати світло мають тільки забарвлені біл­ки (так звані хромопротеїди, наприклад, гемоглобін, цитохроми та ін.), тоді як в уль­трафіолетовій області – практично всі. Найчастіше для кількісних визначень викорис­товують довжину хвилі 280 нм, оскільки при цій довжині хвилі більшість білків мають максимальне поглинання, зумовлене наявністю в їхньому складі залишків амінокис­лот тирозину і триптофану.

Визначенню білка даним методом заважає наявність в розчині нуклеотидів, нуклеї­нових кислот та деяких інших речовин, які також сильно поглинають ультрафіолетове світло. Саме тому метод використовують за відсутності цих сполук в очищених препа­ратах білка.

Спектрофотометричний метод відносно неточний, оскільки кількість триптофану і тирозину в різних білках варіює в широких межах. Цей метод дає добрі результати з гетерогенною сумішшю білків, а також з досить чистими препаратами індивідуальних білків. Для роботи із сумішами білків умовно приймають, що одна одиниця оптичної густини розчину при 280 нм відповідає концентрації білків приблизно 1 мг/мл (при цьому використовують кварцову кювету з довжиною оптичного шляху 1 см). Незважа­ючи на неточності, метод спектрофотометричного визначення концентрації білка в су­часній біохімії застосовують досить часто, оскільки його перевагами є простота ви­конання і, найголовніше, можливість використовувати розчин білка після визначення оптичної густини для інших дослідів. Описаний метод зручний також для контролю за змінами концентрації білків в елюаті при хроматографії білків, тобто для побудови так званих “профілів елюції”.

Хід роботи.

Спектрофотометричний метод – найпростіший метод визначення концентрації біл­ка, оскільки для цього треба тільки визначити оптичну густину розчину при 280 нм. Вимірювання проводять на спектрофотометрі СФ-46 (або іншому) з використанням дейтерієвої лампи в кварцових кюветах. Контролем слугує кювета з водою. Якщо по­глинання розчину дуже велике, то цей білковий розчин розводять у кілька разів і ви­значають оптичну густину розведеного розчину; при кількісних розрахунках врахову­ють використане розведення.