Лабораторна робота № 7 Спектрофотометричний і колориметричний методи визначення концентрації речовин

Потрібно знати:

1) межі застосування колориметричного та спектрофотометричного аналізів;

2) закон Бугера-Ламберта-Бера та причини відхилення від закону на практиці;

3) особливості будови фотоелектроколориметра та спектрофотометра;

4) що таке калібрувальний графік та основні вимоги до його побудови.

Потрібно вміти:

1) за законом Бугера-Ламберта-Бера визначити концентрацію речовини у розчині, якщо відома оптична густина цього розчину, коефіцієнт молярної екстинкції речовини та товщина шару кювети, який поглинає світло;

2) приготувати розчин речовини з відомим коефіцієнтом молярного поглинання так, щоб оптична густина цього розчину знаходилась у допустимих межах (для точного аналізу).

Фотометричні методи ґрунтуються на законі поглинання монохроматичного світ­ла Бугера-Ламберта-Бера, який визначає співвідношення між початковою інтенсив­ністю світла та інтенсивністю світла, яке пройшло через розчин (І):

Величина “lg(I₀/I)” характеризує ступінь ослаблення інтенсивності світла після про­ходження променя через розчин. Її називають оптичною густиною (D) розчину або його екстинкцією. Згідно з рівнянням, існує лінійна залежність D від концентрації речовини, яка поглинає світло (с), товщини шару, який поглинає (1), і коефіцієнта молярного по­глинання (). Цей коефіцієнт дорівнює оптичній густині 1 М розчину, якщо товщина світлопоглинаючого шару дорівнює 1 см. Чим більша величина , тим вища чутливість спектрофотометричного методу визначення речовини.

Концентрацію досліджуваної речовини визначають за величиною оптичної густини при відомих  і l:

Як контроль використовують розчинник або розчин, який містить всі компо­ненти, окрім досліджуваної речовини. При визначенні слід пам’ятати, що оптична гу­стина визначається найточніше в інтервалі 0,1–0,5; якщо D досліджуваного розчину бі­льше від 0,5, то розчин бажано розвести розчинником.

Спектрофотометрія ґрунтується на вимірюванні поглинання монохроматичного світла, тобто світла з певною довжиною хвилі. Сучасні спектрофотометри дають високомонохроматизований потік світла. Розчини для досліджень мають бути прозо­рими, без завислих частинок чи повітряних бульбашок, які розсіюють світло. Розчини повинні бути кімнатної температури, щоб не конденсувалась водяна пара на стінках кювет. Кювети для спектрофотометрії повинні бути чистими, сухими і без подряпин. Не можна торкатися пальцями оптичних стінок кювет! Для роботи в області ультрафіолетового світла використовують кварцові кювети, а у видимій області – пла­стикові (крім випадків, коли у суміші є їдкі речовини чи органічні розчинники) або скляні.

Поряд зі спектрофотометрію широко використовують колориметрію. Багато спо­лук, що характеризуються незначним поглинанням світла, після взаємодії з іншими ре­човинами дають забарвлені продукти, концентрація яких пропорційна концентрації ви­хідних речовин. Такі кольорові реакції використовують для виявлення речовини в роз­чині та визначення її концентрації, яка пропорційна оптичній густині. Широке застосу­вання знайшли колориметричні методи кількісного визначення неорганічного фосфату і фосфорвмісних сполук, глікогену, глюкози, фруктози, білка тощо. Для роботи зазвичай використовують спрощені спектрофотометри або фотоелектроколориметри (ФЕК).

Сучасний ФЕК – це оптичний прилад, в якому монохроматизація потоку світла до­сягається за допомогою світлофільтрів. Колориметричний аналіз проводять, порівнюю­чи поглинання досліджуваного розчину з поглинанням стандартних проб. Стандартні проби готують із розчину відомої концентрації. При цьому враховують межі чутливості конкретного методу. Контрольна проба містить всі компоненти, крім речовини, яку до­сліджують. Необхідно пам’ятати, що інтенсивність забарвлення визначається кон­центрацією речовини, але залежить також від температури і часу розвитку забарвлення. Тому стандартні і дослідні проби слід готувати в суворо визначених однакових умовах.

Результати колориметрування стандартних проб оформлюють у вигляді гра­фіка, тобто залежності інтенсивності забарвлення від кількості речовини, яку ана­лізують. По осі абсцис відкладають вміст речовини, а по осі ординат – значення оптичної густини відповідної проби.

Калібрувальний графік повинен мати вигляд прямої, яка виходить з початку коор­динат. Для отримання калібрувального графіка достатньо 5–6-ти стандартних проб. Ви­значивши оптичну густину дослідних проб (проти контрольної проби), проводять роз­рахунки за допомогою калібрувального графіка. Якщо оптична густина дослідної проби виходить за межі графіка, то роблять нову пробу так, щоб її оптична густина знаходи­лась в області точок калібрувального графіка. За графіком визначають вміст речовини, яка аналізується, і, знаючи об’єм розчину, розраховують її концентрацію.

Хід роботи.

1) Визначення концентрації пероксиду водню Н₂О₂

Спектофотометрування проводять у кварцовій кюветі. Пероксид водню поглинає в ультрафіолетовій області з максимумом поглинання при 240 нм. Коефіцієнт молярного поглинання ₂₄₀ = 39,4 М^–1см^–1.

Досліджуваний розчин має приблизну концентрацію 1 М. Якщо 1 М розчин розвес­ти в 100 разів (10 мМ), то оптична густина повинна становити 0,394. Об’єм розчину, який треба взяти для визначення оптичної густини, дорівнює 2 мл. Тобто, щоб отрима­ти 10 мМ розчин Н₂О₂ в кюветі, треба взяти 0,02 мл 1 М Н₂О₂ і 1,98 мл води. Контроль­на проба повинна містити тільки воду. Вища точність визначення досягається з ви­користанням мірних колб. У даному прикладі можна використати мірну колбу на 25 мл. Слід взяти 0,25 мл вихідного (~ 1 М) розчину Н₂О₂, перенести в колбу і довести об’єм водою до мітки 25 мл.

Визначити оптичну густину розчину і розрахувати істинну концентрацію Н₂О₂ у ви­хідному розчині.

2) Визначення концентрації NADH

Максимум поглинання NADH (а також іншого відновленого коферменту – NADPH) знаходиться при довжині хвилі 340 нм: ₃₄₀ = 6220 М^–1см^–1.

Досліджуваний розчин має приблизну концентрацію 16 мМ. Розрахувати об’єм цього розчину, який треба взяти, щоб отримати оптичну густину 0,311 (об’єм кювети 2 мл). Після вимірювання оптичної густини розрахувати істинну концентрацію дослід­жуваного розчину.