- •Перелік абревіатур
- •Лабораторна робота № 1 Якісні реакції на білки
- •Лабораторна робота № 2 Фізико-хімічні властивості білків
- •Лабораторна робота № 3 Висолювання білків
- •Лабораторна робота № 4 Визначення ізоелектричної точки білків
- •Лабораторна робота № 5
- •Лабораторна робота № 6 Фракціонування білків сульфатом амонію
- •Лабораторна робота № 7 Спектрофотометричний і колориметричний методи визначення концентрації речовин
- •Лабораторна робота № 8 Колориметричне визначення концентрації білка методом Бредфорда
- •Лабораторна робота № 9 Спектрофотометричний метод визначення концентрації білка, який ґрунтується на здатності поглинати ультрафіолетове світло
- •Лабораторна робота № 10 Визначення вмісту сечовини в сечі
- •Лабораторна робота № 11 Електрофорез білків у поліакриламідному гелі
- •Іі. Вуглеводи Лабораторна робота № 12 Якісні реакції на вуглеводи
- •Лабораторна робота № 13 Кількісне визначення глюкози і глікогену
- •Лабораторна робота № 14 Кількісне визначення фруктози на основі реакції Селіванова
- •Лабораторна робота № 15 Кількісне визначення піровиноградної кислоти колориметричним методом
- •Лабораторна робота № 16 Визначення концентрації лактату ензиматичним методом
- •Лабораторна робота № 17 Вивчення властивостей жирів
- •Лабораторна робота № 18 Визначення йодного числа ліпідів
- •Лабораторна робота № 19 Кількісне визначення холестеролу (за Блюром)
- •Іv. Нуклеїнові кислоти Лабораторна робота № 20 Визначення сумарного вмісту нуклеїнових кислот
- •Лабораторна робота № 21 Визначення вмісту нуклеїнових кислот з дифеніламіном
- •Лабораторна робота № 22 Визначення активності дезоксирибонуклеаз
- •V. Вітаміни і гормони Лабораторна робота № 23 Кількісне визначення вітаміну с (за Тильманом)
- •Лабораторна робота № 24 Кількісне визначення вітаміну р (катехінів) за Левенталем
- •Лабораторна робота № 25 Реакція вітаміну рр з гідросульфітом натрію
- •Лабораторна робота № 26 Окислення вітаміну в1 до тіохрому
- •Лабораторна робота № 27 Відновлення рибофлавіну
- •Лабораторна робота № 28 Кількісне визначення вітаміну а
- •Лабораторна робота № 29 Кількісне визначення вітаміну d
- •Лабораторна робота № 30 Кількісне визначення вітаміну е
- •Лабораторна робота № 31 Якісні реакції та кількісне визначення адреналіну
- •VI. Ферменти Лабораторна робота № 32 Визначення активності ферментів спектрофотометричним методом
- •Лабораторна робота № 33 Вплив різних чинників на активність α-амілази слини
- •Лабораторна робота № 34 Визначення кінетичних характеристик ферментів на прикладі лактатдегідрогенази
- •Лабораторна робота № 35 Активація та інгібування ферментів (на прикладі фосфофруктокінази)
- •Лабораторна робота № 36 Інгібування лактатдегідрогенази надлишком субстрату
- •Лабораторна робота № 37 Визначення активності амф-дезамінази
- •Лабораторна робота № 38 Очистка амф-дезамінази
- •Лабораторна робота № 39 Очистка лактатдегідрогенази шляхом висолювання сульфатом амонію
- •Vіі. Вільнорадикальні процеси Лабораторна робота № 40 Визначення активності супероксиддисмутази (сод)
- •Лабораторна робота № 41 Визначення активності глутатіонпероксидази
- •Лабораторна робота № 42 Визначення активності глутатіонредуктази
- •Лабораторна робота № 43 Визначення активності глутатіон-s-трансферази
- •Лабораторна робота № 44 Визначення вмісту карбонільних груп у білках
- •Лабораторна робота № 45 Визначення вмісту пероксидів ліпідів
- •Лабораторна робота № 46 Визначення вмісту тбк-активних продуктів
- •Лабораторна робота № 47 Визначення вмісту тіолових груп
- •Лабораторна робота № 48 Визначення вмісту глутатіону
- •Питання контролю рівня знань на підсумкових заняттях
- •Програмові вимоги до куpсу “Біохімія”
- •Рекомендована література Теоретичний курс
- •Практичний курс
Лабораторна робота № 41 Визначення активності глутатіонпероксидази
Потрібно знати:
1) хімічну будову глутатіону та його функції в клітині;
2) перетворення, у яких бере участь глутатіон; шляхи синтезу та розпаду глутатіону в клітині;
3) біологічну роль глутатіонпероксидази.
Потрібно вміти:
1) написати рівняння реакції, яку каталізує глутатіонпероксидаза.
До антиоксидантних ферментів, пов’язаних з глутатіоном, відносяться глутатіонпероксидаза, глутатіон-S-трансфераза і глутатіонредуктаза.
Глутатіонпероксидаза здійснює детоксикацію пероксиду водню та органічних пероксидів. Цей фермент розкладає пероксиди, використовуючи відновлений глутатіон (GSH) як косубстрат:
H2O2 + 2GSH → GSSG + 2H2O
R–OOH + 2GSH → R–OH + GSSG + H2O
Реактиви:
200 мМ калій-фосфатний буфер (КФБ), рН 7,0; 100 мМ ЕДТА; 25 мМ NADPH; 150 мМ GSH; 40 мМ NaN3, глутатіонредуктаза з пекарських дріжджів.
Хід роботи.
Активність ферменту визначається у спряженій реакції з глутатіонредуктазою. Суміш містить, окрім буферу і ЕДТА, субстрати глутатіонпероксидази – відновлений глутатіон і пероксид водню; в процесі реакції глутатіон окислюється. Останній відновлюється глутатіонредуктазою, для чого у суміш додається NADPH. Хід реакції реєструється за зміною його концентрації при довжині хвилі 340 нм. Для інгібування активності каталази (яка конкурує з глутатіонпероксидазою за субстрат) додається азид натрію (NaN3). Об’єм проби 1 мл. Перед визначенням розрахувати склад середовища для визначення активності ферменту:
Таблиця. Середовище для визначення активності глутатіонпероксидази
№ |
Компоненти суміші |
Кінцева концентрація |
Вихідна концентрація |
На 1 пробу (1 мл) |
На 10 проб (10 мл) |
1. |
КФБ |
50 мМ |
200 мМ |
|
|
2. |
ЕДТА |
0,5 мМ |
100 мм |
|
|
3. |
NADPH |
0,25 мМ |
25 мМ |
|
|
4. |
GSН |
15 мМ |
150 мМ |
|
|
5. |
NaN3 |
4 мМ |
40 мМ |
|
|
6. |
Глутатіонредуктаза |
|
|
1 Од/мл |
|
7. |
Н2О2 |
0,2 мМ |
20 мМ |
|
|
8. |
Вода |
– |
– |
|
|
9. |
Препарат |
– |
– |
|
|
Суміш містить перші 6 компонентів за таблицею 2 і воду. Спочатку визначають базову активність суміші, додаючи в кювету 0,98 мл суміші і 0,02 мл пероксиду водню. Активність ферменту в пробі визначають, послідовно додаючи в кювету суміш, пероксид водню і препарат. Для розрахунку активності від зміни оптичної густини (за хвилину) дослідної проби віднімають зміну оптичної густини (за хвилину) контрольної проби.
В препараті визначити концентрацію білка методом Бредфорда (див. роботу № 8) і розрахувати активність глутатіонпероксидази за формулою, наведеною у роботі № 32.