Лабораторна робота № 3 Висолювання білків

Потрібно знати:

1) класифікацію білків;

2) приклади складних і простих білків та їхні функції;

3) причини осідання білка при висолюванні та відмінність цього процесу від денатура­ції;

4) фактори, які впливають на осідання білків при висолюванні.

Висолювання білків – це зворотна реакція осадження білків із водних розчинів при додаванні високих концентрацій нейтральних солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, NaCl та ін.). При висолюванні відбувається втрата водної оболонки (дегідратація) макромо­лекулами білків і нейтралізація їхнього заряду; у зв’язку з цим білки випадають в осад. На процес висолювання впливає ціла низка факторів: гідрофільність білків, молекуляр­на маса, заряд білкової молекули, іонна сила розчину тощо. Різні білки осаджуються при різних концентраціях солей. Так, глобуліни легше випадають в осад, ніж альбумі­ни. Тому в осадах, які отримані шляхом поступового підвищення концентрації солі, окремі білки знаходяться в різних фракціях (див. роботу №6). Для розділення білків цим методом широко використовують сульфат амонію. Оскільки у глобулінів більша молекулярна маса, ніж в альбумінів, то вони випадають в осад у напівнасиченому роз­чині, тоді як альбуміни – при повному насиченні. Осад білків може знову розчинятися після зменшення концентрації солі шляхом діалізу або розведення водою. Дегідратуючі властивості солей описуються рядом Ґофмейстера і знижуються у наступній послідов­ності:

SO₄^2- > Cl^- > Br^- > NO₃^- > I^- > CNS^-

Ca²⁺ > Li⁺ > Na⁺ > K⁺ > Rb⁺ > Cs⁺

Висолювання білків є зворотнім процесом, і після зменшення концентрації солі (внаслідок діалізу, розведення водою) білок знову стає нативним.

Реактиви.

10% розчин яєчного білка, насичений розчин сульфату амонію (NH₄)₂SO₄, криста­лічний сульфат амонію.

Хід роботи.

В пробірку налити 4 мл розчину яєчного білка, додати такий же об’єм насиченого розчину сульфату амонію, перемішати. Утворюється напівнасичений розчин сульфату амонію і випадають в осад глобуліни. Через 5 хв осад відфільтрувати. У фільтраті за­лишиться яєчний альбумін.

Для висолювання альбуміну до фільтрату додати кристалічний сульфат амонію до повного насичення (доки сіль не перестане розчинятись). Осад альбуміну відфільтрува­ти.

З фільтратом провести біуретову реакцію (див. лаб. роб. № 1), щоб підтвердити від­сутність білка.

Результати занести у таблицю.

Білок	Сіль	Ступінь насичення	Утворення осаду
Глобулін Альбумін

Лабораторна робота № 4 Визначення ізоелектричної точки білків

Потрібно знати:

1) що таке ізоелектрична точка амінокислот та білків;

2) що таке ізоіонна точка білків.

Потрібно вміти:

1) визначати приблизне значення ізоелектричної точки білка, якщо відомо які (за заря­дом) амінокислоти переважають у його складі.

Ізоелектричною точкою білків називається така величина рН середовища, при якій білок знаходиться у вигляді нейтральних молекул (в ізоелектричному стані), що несуть рівну кількість позитивних і негативних зарядів. При вищих або нижчих значеннях рН в розчині переважають позитивні або негативні іони білків. Білки в ізоелектричній точ­ці найменш стабільні в розчинах і легко випадають в осад. Для більшості білків рН ізоелектричної точки наближене до нейтрального; для інших – воно зсунуте в бік низьких значень, а деякі білки мають нейтральний заряд у слабколужному середовищі. Визначення ізоелектричної точки білка означає на практиці визначення рН розчину, при якому спостерігається найшвидше і найповніше випадання білка в осад. Для одержання розчинів з різною величиною рН користуються буферними розчинами.

В даній роботі визначають ізоелектричну точку казеїну. На відміну від інших білків казеїн осаджується в ізоелектричній точці без додавання речовин, які віднімають воду.

Реактиви.

0,2 М оцтова кислота, 0,4% розчин казеїну в ацетаті натрію.

Хід роботи.

Для визначення ізоелектричної точки казеїну в сім сухих пробірок налити необхідні реактиви в кількостях, вказаних у таблиці:

Об’єм 0,2 М оцтової кислоти, мл	Об’єм води, мл	Об’єм 0,4% розчину казеїну в 0,2 М ацетаті натрію, мл	рН суміші	Ступінь каламутності
1,60 0,80 0,40 0,20 0,10 0,06 0,03	0,40 1,20 1,60 1,80 1,90 1,94 1,97	0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20	3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6

Примітка: В графі “ступінь каламутності” відсутність осаду позначається знаком “–”, наявність його – “+”, значна каламутність – кількома плюсами.

При змішуванні розчинів у кожній пробірці встановлюється певна концентрація іонів водню (рН). Вміст пробірок добре перемішати. Через 5-10 хвилин в усіх пробірках з’являється осад (помутніння). Найбільша кількість осаду спостерігається в тій про­бірці, рН якої відповідає ізоелектричній точці даного білка.