Лабораторна робота № 35 Активація та інгібування ферментів (на прикладі фосфофруктокінази)

Потрібно знати:

1) в чому полягає активація та інгібування ферментів;

2) визначення (в ензимології) понять “ефектор”, “активатор”, “інгібітор”, „каталітичний центр”, “алостеричний центр”;

3) види інгібування активності ферментів (конкурентне і неконкурентне; зворотне і не­зворотне);

4) кінетичні параметри, які характеризують активацію та інгібування ферментів (кон­станти К₅₀, І₅₀ тощо);

5) сутність регуляції активності ферменту шляхом фосфорилювання/дефосфорилюваня, метилювання/деметилювання, нітрозилювання та глікозилювання.

Потрібно вміти:

1) написати рівняння реакції, яку каталізує фосфофруктокіназа.

На активність ферментів впливають ефектори – активатори та інгібітори. Вони зв’я­зуються з алостеричними центрами, що призводить до зміни конформації чи блоку­вання активного центру і, як наслідок, до зміни спорідненості ферменту до субстрату.

Лінійне інгібування характеризується константою половинного інгібування (І₅₀), яка відповідає концентрації інгібітора, за якої швидкість реакції зменшується наполови­ну від максимальної. Для олігомерних ферментів відоме явище кооперативності, коли зв’язування інгібітора з однією субодиницею впливає на його зв’язування з іншими субодиницями. Форма кривої в цих випадках підбирається емпірично. Якщо не спо­стерігається повного інгібування, то константа половинного інгібування К₅₀ відповідає концентрації інгібітора, за якої

,

де V₀ і V_min – відповідно початкова (без інгібітора), або максимальна, і мінімальна за­реєстрована швидкості реакції.

Хід роботи.

Для виконання цієї роботи використати оригінальні дані, отримані в біохімічній ла­бораторії щодо впливу ефекторів та субстратів на активність фосфофруктокінази (ФФК).

1. Інгібування ФФК субстратом реакції – АТФ

мМ АТФ	Швидкість реакції (ум.од.)
1,0 2,0 3,5 5,0 6,5 8,0 10,0	67 64 57 51 42 37 30

Провести комп’ютерну обробку (програма “KINETICS”) отриманих даних і підібрати криву інгібування, яка найкраще описує експериментальні точки. Роз­рахувати константу К₅₀ і n_H, який при відмінності від одиниці свідчить про наявність кінетичної кооперативності для АТФ.

2) Інгібування ФФК цитратом

мкМ цитрату	Швидкість реакції (ум.од.)
0 30 60 250 500 750 1000 1500 3500	56 51 47 37 27 22 17 14 8

За допомогою комп’ютерної програми підібрати криву інгібування і розрахувати константу І₅₀ (лінійне інгібування).

3) Активація ФФК специфічним метаболітом фруктозо-2,6-дифосфатом (Фр-2,6-Ф₂)

мкМ Фр-2,6-Ф2	Швидкість реакції (ум.од.)
0 0,10 0,20 0,35 0,50 0,75 2,00	34 43 47 49 51 52 53

Провести розрахунки константи активації (К_а) для Фр-2,6-Ф₂ за допомогою комп’ю­терної програми.