VI. Ферменти Лабораторна робота № 32 Визначення активності ферментів спектрофотометричним методом

Потрібно знати:

1) визначення понять “активність ферменту”, “енергія активації”, “активний центр фер­менту”;

2) одиниці кількісного вираження активності ферментів та “види” активності;

3) приклади різних методів визначення активності ферментів: колориметричного, манометричного, титриметричного тощо; переваги і недоліки спектрофотометричного методу;

4) умови, при яких можливе визначення активності ферментів спектрофотометричним методом;

5) сутність методу застосування спряжених реакцій при спектрофотометричному ви­значенні активності ферменту;

6) теоретичні принципи спектрофотометрії (лабораторна робота № 7).

Потрібно вміти:

1) виводити формулу для розрахунку питомої активності ферменту при визначенні її спектрофотометричним методом.

Визначення активності ферментів спектрофотометричним методом ґрунтується на поглинанні світла згідно із законом Бугера-Ламберта-Бера (див. також лабораторну роботу № 7):

де: І₀ – початкова інтенсивність світла,

І – інтенсивність світла після проходження через розчин,

l – довжина оптичного шляху променя у розчині, см,

с – концентрація (молярна) речовини, яка поглинає світло,

 – коефіцієнт молярного поглинання, М^–1см^–1.

Величина “lg (I₀/I)” називається оптичною густиною (D).

Активність ферментів визначається як швидкість зміни концентрації субстрату або продукту реакції. За одну одиницю активності ферменту прийнята така його кількість, яка каталізує використання 1 мкмоля субстрату або утворення 1 мкмоля продукту за одну хвилину при 25С.

Для розрахунку специфічної активності ферменту підраховують, скільки одиниць активності ферменту припадає на 1 мг білка.

Активність ферменту розраховують за формулою:

де: А – специфічна активність, Од/мг білка;

D – зміна оптичної густини за 1 хв.;

V_пр – об’єм проби, в якій визначається швидкість реакції, в мл;

 – коефіцієнт молярного поглинання, М^–1см^–1;

l – довжина оптичного шляху променя світла;

n_преп – об’єм препарату (в мл), який додається в пробу;

[білок]_преп – концентрація білка в препараті, мг/мл.

Реактиви.

200 мМ калій-фосфатний буфер (КФБ), рН 7,0; 100 мМ розчин пірувату, 100 мМ розчину динатрієвої солі етилендиамінтетраацетату (ЕДТА), 16 мМ NADH, 1 М Н₂О₂, екстракти тканин.

Хід роботи.

1) Визначення активності лактатдегідрогенази (ЛДГ) в препараті м’язів

Лактатдегідрогеназа каталізує наступну реакцію:

Активність ферменту в прямій реакції визначається за зміною концентрації NADH. Коефіцієнт молярного поглинання NADH при 340 нм становить 6220 М^–1см^–1. Зміну оптичної густини реєструють на ФЕК через кожні 10 сек протягом 2 хв або на спектрофотометрі СФ-46 в циклічному режимі при 340 нм. В останньому випадку ви­користовують лампу розжарювання.

Перед визначенням розрахувати склад середовища для визначення активності ЛДГ (табл. 1). Об’єм проби становить 2 мл.

Таблиця 1. Склад середовища для визначення активності ЛДГ

Компоненти	Кінцева концентрація	Вихідна концентрація	На 1 пробу (2 мл), мкл	На 5 проб (10 мл), мкл
КФБ	50 мМ	200 мМ
Піруват	1 мМ	100 мМ
ЕДТА	0,5 мМ	100 мМ
NADH	160 мкМ	16 мМ
Препарат	–	–	5–10 мкл
Вода	–	–

В кювету додати 1,990–1,995 мл середовища для визначення активності ферменту, а потім 5–10 мкл препарату. Оптимальною слід вважати зміну оптичної густини в 0,05–0,1 одиниць за хвилину.

Окремо визначити концентрацію білка методом Бредфорда (лабораторна робота № 8) і розрахувати специфічну активність ЛДГ.

Правила коректного визначення активності ферменту:

1) Правило 1 (Мал. А): Для розрахунків активності ферменту слід вибирати діапазон, в якому кількість використаного субстрату (утвореного продукту) – S/P – змінюється протягом часу лінійно.

Для цього треба на початку роботи реєструвати швидкість реакції протягом кількох хвилин, щоб вибрати лінійний діапазон зміни оптичної густини в часі. Як правило, швидкість реакції максимальна на початку, а потім поступово знижується, чим порушується лінійність вказаної залежності. Проте є реакції (наприклад, каталізована глутатіонпероксидазою (див. роботу №41)), в яких швидкість реакції зростає з часом; в цих випадках розрахунки ведуть в діапазоні найвищої швидкості реакції.

2) Правило 2 (Мал. Б): Розрахунки активності ферменту слід проводити на основі виз­начень, для яких швидкість реакції (пронормована на використаний об’єм препарату) не залежить від кількості внесеного в суміш препарату.

Для цього необхідно визначити швидкість реакції для кількох (3–4) різних об’ємів препарату і побудувати графік, на осі абсцис якого відкласти об’єми препарату (або вміст білка в ньому), а на осі ординат – зміну оптичної густини за хвилину. Вибирається такий об’єм, який потрапляє в лінійний діапазон графіка.

3) Правило 3 (Мал. В): Розрахунки активності ферменту слід проводити на основі визначень, в яких швидкість реакції мало залежить від концентрації субстратів. Як правило, використовують такі концентрації субстратів, які забезпечують 95% від мак симальної активності, а концентрації субстратів в ході визначення знижуються не біль ше, ніж на 10%.

Малюнки, наведені нижче, ілюструють три правила визначення активності ферментів. Сірим кольором позначені ділянки, які використовуються для коректного визначення активності.

2) Визначення активності каталази в препаратах печінки

Каталаза перетворює пероксид водню до води і молекулярного кисню:

2Н₂О₂ → О₂ + 2Н₂О

Швидкість реакції реєструється за зміною концентрації пероксиду водню при 240 нм. Робота виконується на спектрофотометрі СФ-46 (дейтерієва лампа). Коефіцієнт молярного поглинання пероксиду водню при вказаній довжині хвилі становить 39,4 М^–1см^–1 (див. роботу №7). Перед визначенням розрахувати склад суміші на 5 проб (табл. 2). Об’єм однієї проби становить 2 мл. Пероксид водню в суміш не додавати!

Таблиця 2. Склад середовища для визначення активності каталази

Компоненти	Кінцева концентрація	Вихідна концентрація	На 1 пробу (2 мл), мкл	На 5 проб (10 мл), мл
КФБ	50 мМ	200 мМ
ЕДТА	0,5 мМ	100 мМ
Н2О2	10 мМ	1 М
Препарат	–	–	2–5
Вода	–	–

В кварцову кювету для спектрофотометрії додати послідовно 1,975 мл суміші для визначення активності, 5 мкл препарату ферменту і, в останню чергу, 20 мкл пероксиду водню. Визначити швидкість зміни оптичної густини. Визначити концентрацію білка у препараті і розрахувати активність каталази.

Для коректного розрахунку активності ферменту спочатку необхідно знайти залеж­ність швидкості реакції від часу (правило 1), кількості внесеного препарату (правило 2) і кількості субстрату (правило 3).