Лабораторна робота № 2 Фізико-хімічні властивості білків

Потрібно знати:

1) основні фізичні і хімічні властивості білків, зокрема:

а) діапазон молекулярних мас амінокислот, пептидів та білків,

б) особливості розчинності білків і властивості білкових розчинів,

в) приблизний розмір білкових молекул,

г) сутність явищ денатурації та ренатурації білків (умови виникнення та механізм явища),

д) характер взаємодії білків з органічними та неорганічними речовинами;

2) структурну організацію білкових молекул та хімічні зв’язки, які стабілізують білко­ву молекулу (пояснити фізико-хімічну сутність кожного типу зв’язку).

Потрібно вміти:

1) написати, як перерозподіляються заряди в молекулі будь-якої амінокислоти при зміні рН;

2) визначити приблизне значення ізоелектричної точки (рІ) для заданого ди- і трипеп­тида.

Білки – високомолекулярні органічні сполуки, які складаються з амінокислот. Білки – гідрофільні, тобто мають високу спорідненість до води. Вони утворюють колоїдні розчини, що можна встановити за ефектом Тиндаля.

Якщо в затемненому приміщені пропускати світловий промінь через колоїдний розчин і дивитися на роз­чин збоку, то шлях променя в розчині можна спостерігати у вигляді світлої «доріжки». Це зумовлено здат­ністю колоїдних частинок розсіювати світло. На малюнку: А – склянка з істинним розчином; Б – склянка з колоїдним розчином.

Колоїдні розчини білків достатньо стійкі. Оскільки білкова молекула несе електри­чний заряд, то навколо неї утворюється гідратна оболонка з кількох шарів молекул води, яка перешкоджує взаємодії білкових молекул між собою. Наявність гідратної оболонки пояснюється тим, що білкові молекули мають велику кількість гідрофільних залишків амінокислот.

Електричний заряд зумовлений здатністю молекули білка дисоціювати у водних розчинах і утворювати іони. Білки, як і амінокислоти, завдяки одночасній наявності карбоксильних та аміногруп є амфотерними електролітами. Тобто, в кислому середо­вищі вони проявляють лужні властивості і мають позитивний заряд. В лужному середо­вищі білки проявляють кислотні властивості і мають негативний заряд. Значення рН, при якому білки несуть рівну кількість позитивних і негативних зарядів, називається ізоелектричною точкою. В ізоелектричній точці білок втрачає заряд і легко випадає в осад.

Денатурація білка – це порушення структури білка, яке призводить до втрати ним біологічних властивостей. Незворотна денатурація спостерігається під впливом солей важких металів, мінеральних і органічних кислот, кип’ятіння. При зворотній денатура­ції молекула білка тимчасово втрачає біологічні властивості, але за певних умов вони можуть бути відновлені. Така денатурація спостерігається при дії органічних розчин­ників (спирту, ацетону), висолюванні білків.

Реактиви.

10% розчин яєчного білка, 1% і 10% розчини оцтової кислоти, 10% розчин NaOH, насичений розчин NaCl, етиловий спирт (96 % об.), ацетон, концентровані неорганічні кислоти: HCl, HNO₃, H₂SO₄; 10% розчини трихлороцтової та сульфосаліцилової кислот; 7% розчин CuSO₄, 5% розчини AgNO₃ та Pb(CH₃COO)₂.

1) Осадження білків нагріванням

Переважна більшість білків денатурує при нагріванні до температури вищої від 50С. Механізм денатурації пов’язаний з перебудовою структури білкової молекули, в результаті якої білок втрачає свої функціональні властивості, зменшується його роз­чинність. Найбільш повне і швидке осадження відбувається в ізоелектричній точці.

Хід роботи.

У 5 пронумерованих пробірок налити по 2 мл 10% розчину яєчного білка. Вміст першої пробірки нагріти на відкритому полум’ї. Розчин стане каламутним. Проте, ос­кільки білкові частинки несуть заряд, то вони перебувають у завислому стані (яєчний альбумін – це кислий білок, який в нейтральному середовищі має негативний заряд).

В пробірку №2 додати 0,2 мл 1% розчину оцтової кислоти і нагріти. Випаде білий осад білка як результат втрати заряду і наближення до ізоелектричної точки.

В пробірку №3 додати 0,2 мл 10% розчину оцтової кислоти і нагріти. Випадання білкового осаду не спостерігається навіть при кип’ятінні, оскільки в сильно кислому середовищі молекули білка мають позитивний заряд.

В пробірку №4 додати 0,2 мл 10% розчину оцтової кислоти і 1 краплю насиченого розчину хлориду натрію. Утворений осад є результатом адсорбції іонів хлориду натрію на поверхні білкової молекули і нейтралізації позитивного заряду на частинках білка.

В пробірку №5 додати 0,2 мл 10% розчину NaOH і нагріти. Осад не випадає навіть при кип’ятінні, оскільки в сильно лужному середовищі негативний заряд на частинках білків посилюється, що стабілізує їх у розчині.

Результати роботи занести в таблицю:

Нейтральне середовище	Слабкокисле середовище	Кисле середовище	Кисле середовище з електролітом	Лужне середовище

2) Осадження білків органічними розчинниками

Більшість білків нерозчинні в органічних розчинниках (спирт, ацетон, ефір). Орга­нічні розчинники дегідратують білки, руйнуючи водну оболонку і тим самим знижую­чи їхню стійкість у розчині.

Хід роботи.

Роботу проводити у витяжній шафі! В пробірку налити 0,5 мл 10% розчину яєч­ного білка і 2 мл етилового спирту або ацетону; розчин стане каламутним. При до­даванні 0,5 мл насиченого розчину хлориду натрію випадає осад білка.

3) Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами

Концентровані мінеральні кислоти викликають денатурацію білка. При цьому утво­рюються комплексні солі білка з кислотами. Винятком є ортофосфорна кислота, при додаванні якої до розчину білка осаду не спостерігається. Осади білка розчиняються в надлишку всіх мінеральних кислот, крім азотної, можливо, за рахунок перезарядження білка і часткового гідролізу.

Хід роботи.

Роботу проводити у витяжній шафі! В три пробірки налити по 1–2 мл концентро­ваних соляної, сірчаної та азотної кислот. По стінці пробірки налити такий же об’єм розчину білка. На межі між двома шарами рідин утворюється осад білка у вигляді то­ненької білої плівочки. При струшуванні спостерігається розчинення білків у соляній та сірчаній кислотах, а в азотній осад не зникає.

4) Осадження білків органічними кислотами

Білки із розчинів можуть осаджуватись також і органічними кислотами. Трихлор­оцтова та сульфосаліцилова кислоти є дуже чутливими і специфічними реактивами на білки.

Хід роботи.

Роботу проводити у витяжній шафі! У дві пробірки налити по 1 мл 10% розчину білка, в одну додати 0,2–0,4 мл 10% розчину сульфосаліцилової, а в другу – 1,5 мл 10% трихлороцтової кислоти. В пробірках утворюються осади білків.

5) Осадження білків солями важких металів

Білки при взаємодії із солями Pb, Cu, Ag, Hg та ін. адсорбують їх, утворюючи соле­подібні і комплексні сполуки, нерозчинні у воді, але розчинні у надлишку солі (крім AgNO₃, HgCl₂).

Хід роботи.

В три пробірки внести по 1 мл 10% розчину яєчного білка і додати відповідно по 0,2 мл сульфату міді (7%), розчину ацетату свинцю (5%), нітрату срібла (5%). Спостерігається утворення осаду. До першої пробірки додати ще 1-2 мл 7% розчину сульфату міді. При цьому відбувається розчинення осаду. В третю пробірку додати такий же об’єм нітрату срібла – розчинення осаду не спостерігається.