Лабораторна робота № 22 Визначення активності дезоксирибонуклеаз

Потрібно знати:

1) принципи методів, які вивчаються;

2) роль ДНКаз у клітині та спектр їхнього застосування у генетичній інженерії.

Потрібно вміти:

1) написати рівняння реакції, яку каталізує ДНКаза.

Нуклеази каталізують гідроліз фосфодиефірних зв’язків у високополімерних молекулах нуклеїнових кислот. В результаті реакції утворюється суміш оліго- та моно­нуклеотидів.

1) Спектрофотометричне визначення активності дезоксирибонуклеаз

Реактиви.

Розчин натрієвої солі ДНК (2 мг/мл), 50 мМ розчин сульфату магнію, 0,1 М ацетат­ний буфер, препарат дезоксирибонуклеази.

Хід роботи.

Активність визначають в середовищі, склад якого наведений в таблиці. Об’єми ре­активів потрібно обчислити самостійно, враховуючи те, що загальний об’єм проби в кюветі становить 2 мл.

Таблиця. Склад середовища для визначення активності дезоксирибонуклеази

Компоненти	Кінцева концентрація	Вихідна концентрація	На одну пробу (2 мл), мкл	На п’ять проб (10 мл), мкл
Розчин Na–ДНК	0,04 мг/мл	2 мг/мл
Ацетатний буфер	0,05 М	0,1 М
MgSO4	5 мМ	50 мМ
Вода	–	–
Препарат	–	–	100

В кварцову кювету внести по 1,9 мл середовища для визначення активності (температура дорівнює 25°С), і за даною сумішшю обнулити спектрофотометр при довжині хвилі 260 нм. Додати в кювету 100 мкл препарату, який містить 20–30 мкг дезоксирибонуклеази, і знімати покази оптичної густини протягом п’яти хвилин. За одну одиницю активності приймають кількість ферменту, яка здатна за 1 хв призводити до збільшення оптичної густини при 260 нм на одну одиницю. Визначити концентра­цію білка у препараті (див. роботу № 8) і розрахувати питому активність (робота № 32) дезоксирибонуклеази.

2) Метод Олфрі та Мірського

Реактиви.

Субстратний розчин: до 1 мл розчину натрієвої солі ДНК (2 мг/мл) додати 1 мл розчину Na₂SO₄ і 0,4 мл розчину фенолового червоного (фенолсульфофталеїну), довес­ти рН до 7,5 додаванням 0,01 н. розчину NaOH і розвести дистильованою водою до об’єму 3 мл.

Розчин фенолового червоного: у мірній колбі на 100 мл змішати 10 мг фенол­сульфофталеїну, 0,28 мл 0,1 н. розчину NaOH, 3 мл етанолу (96% об.), 40 мл 70 мМ калій-фосфатного буферу з рН 7,5, після чого довести водою до мітки.

Хід роботи.

15 мг тканини швидко розтерти в 10 мл охолодженого фізіологічного розчину та центрифугувати при 10000 g протягом 15 хв. В кювету спектрофотометра додати 0,5 мл надосадової рідини (супернатанту), яка містить ДНКазу, і 1,5 мл субстратного розчину. Визначати оптичну густину на спектрофотометрі в циклічному режимі протягом трьох хвилин при 558 нм. За одну одиницю активності приймають таку кількість ферменту, яка призводить до зниження оптичної густини на 1,0 за хвилину. Для розрахунку питомої активності обчислене значення активності ділять на значення концентрації білка в супернатанті.