Лабораторна робота № 16 Визначення концентрації лактату ензиматичним методом

Потрібно знати:

1) принцип ензиматичного визначення концентрації лактату;

2) особливості будови та роль лактатдегідрогенази в організмі людини та діагностичне значення цього ферменту.

Метод ґрунтується на ензиматичному окисленні молочної кислоти до піровиноград­ної ферментом лактадегідрогеназою при одночасному відновленні NAD⁺ до NADH:

Лактат + NAD⁺ Піруват + NADH + Н⁺

Рівновага реакції зсунута в бік утворення молочної кислоти. Проте, якщо утворену піровиноградну кислоту зв’язувати гідразином або семікарбазидом у вигляді гідразонів або семікарбазонів і реакцію проводити в лужному середовищі, то молочну кислоту можна повністю перевести в піровиноградну. Кількість молочної кислоти розрахо­вують за NADH, який утворюється в результаті реакції, визначаючи зміну оптичної гус­тини при 340 нм.

Реактиви.

Гліцин-гідразиновий буфер, рН 9,0 (0,1 М гліцин, 0,1 М гідразин); 30 мМ NAD⁺, рН 6,0; 100 мМ калій-фосфатний буфер, рН 7,4; ЛДГ – 2 мг/мл (комерційний препарат) або екстрат м’язів у розведенні 1:25 (як джерело ферменту); 2 н. NaOH; 0,5 М розчин HСlO₄.

Хід роботи.

1. Приготування гліцин-гідразинового буферу

Розчинити необхідні наважки гліцину і гідразину в невеликій кількості дистильо­ваної води, перенести в мірну колбу на 100 мл, довести значення рН суміші 2 н. NaOH до 9,0 і долити дистильовану воду до мітки.

2. Отримання екстракту м’язів 1:25 (джерела ЛДГ)

Приготувати гомогенат м’язів на 100 мМ калій-фосфатному буфері і центрифугу­вати 10 хв при 15000 g і 4С. Супернатант є екстрактом без ядер, мітохондрій і уламків клітин. Він використовується як джерело ЛДГ. Екстракт можна довго зберігати в за­мороженому стані. Для визначення молочної кислоти використовують екстракт у розведенні 1:25.

3. Визначення лактату

Наважку тканини гомогенізувати в охолодженому 0,5 М розчині надхлорної кисло­ти HСlO₄ (співвідношення тканини і кислоти 1:5, маса:об’єм) і екстрагувати на холоді 30 хв. Осаджені білки відділити центрифугуванням протягом 15 хв при 15000 g. Супернатант нейтралізувати 5 н. розчином КОН і залишити на льоді не менш, ніж на годину (можна на ніч). Осад перхлорату калію KClO₄ відділити центрифугуванням при 4°С. В отриманому супернатанті визначити вміст лактату.

Приготувати проби для визначення концентрації молочної кислоти згідно з таблицею.

Склад проби	Об’єм, мл
	Контрольна	Дослідна
Гліцин-гідразиновий буфер 30 мМ NAD+ Розчин ЛДГ або екстракт м’язів Н2О Досліджуваний розчин	2,6 0,2 0,1 0,1 	2,6 0,2 0,1  0,1

Ретельно перемішати вміст пробірок і помістити їх у термостат при 25°С на 60 хв. Після інкубації проби охолодити і визначити оптичну густину проти контрольної проби. Кількість молочної кислоти в пробі розрахувати, враховуючи всі розведення.

де: С – концентрація лактату, нмоль/г тканини;

D – різниця між оптичними густинами дослідної і контрольної проб;

V_пр – об’єм проби (в даному випадку 3 мл);

Р – розведення, використане при приготуванні гомогенату (в даному випадку 6);

 – коефіцієнт молярного поглинання NADH, М^–1см^–1;

l – довжина оптичного шляху променя світла;

n_гом – об’єм препарату (в мл), який додається в пробу.

ІІІ. Ліпіди