Лабораторна робота № 14 Кількісне визначення фруктози на основі реакції Селіванова

Потрібно знати:

1) структурні формули найрозповсюдженіших у живому світі дисахаридів – сахарози, лактози, трегалози, мальтози, целобіози;

2) роль фруктози та її ефірів в організмі.

Потрібно вміти:

1) написати рівняння реакцій, характерних для дисахаридів, здатних і нездатних відновлювати інші сполуки;

2) написати рівняння біохімічних реакцій, в яких беруть участь фосфорні ефіри фруктози;

3) написати рівняння реакції перетворення фруктози в оксиметилфурфурол в кислому середовищі.

Принцип якісної реакції Селіванова ґрунтується на здатності кетоз у вільному стані реагувати з концентрованою соляною кислотою. У випадку фруктози ця реакція прохо­дить з утворенням оксиметилфурфуролу:

Оксиметилфурфурол в присутності резорцину при нагріванні дає продукти конденсації, які мають червоне забарвлення:

Р еактиви.

Реактив Селіванова: 0,1% розчин ре­зорцину в 96% етиловому спирті; стан­дартні розчини (0,5 мг/мл) глюкози, фрук­този, сахарози в 1 М соляній кислоті; 30% соляна кислота; досліджувані розчини фруктози, глюкози чи сахарози.

Хід роботи.

1. Побудова калібрувального графіка

Для побудови калібрувального графіка в 5 пробірок налити відповідно по 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 і 1,0 мл стандартного розчину фруктози і об’єм кожної пробірки довести до 1 мл. В контрольну пробірку налити 1 мл дистильованої води. Потім у всі пробірки дода­ти по 1 мл 0,1% розчину резорцину і по 3 мл 30% соляної кислоти. Перемішати і поміс­тити у водяну баню з температурою 80°С. Через 8 хв проби охолодити і визначити ін­тенсивність червоного забарвлення на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 490 нм. Дані подати графічно, відкладаючи по осі абсцис кількість фруктози в пробі, а на осі ординат – відповідну величину оптичної густини.

2) Визначення концентрації фруктози у досліджуваних розчинах

Досліджувані проби, які містять 0,1–0,5 мг фруктози, обробити так само, як і стандартні. За калібрувальним графіком розрахувати у них точний вміст фруктози.

Лабораторна робота № 15 Кількісне визначення піровиноградної кислоти колориметричним методом

Потрібно знати:

1) хімічні формули піровиноградної кислоти та інших органічних кислот, присутніх в живих організмах, а саме – щавлевої, молочної, щавлевооцтової, янтарної, яблучної, фумарової тощо;

2) за допомогою яких хімічних перетворень (карбоксилювання/декарбоксилювання, гідроксилювання, окислення/відновлення, гідратація/дегідратація) можна отримати з однієї органічної кислоти іншу;

3) роль піровиноградної кислоти в організмі, шляхи її утворення та утилізації.

Потрібно вміти:

1) написати реакцію взаємодії піровиноградної кислоти з 2,4–динітрофенілгідразином.

Піровиноградна кислота – одна з ключових оксокислот у живих організмах. Вона є попередником цілої родини сполук, зокрема, аланіну та оксалоацетату. За рахунок цього вона є спільною ланкою в обміні вуглеводів, білків та ліпідів. Визначення вмісту піровиноградної та інших оксокислот у тканинах може мати діагностичне значення.

Принцип методу ґрунтується на реакції оксогрупи з 2,4-динітрофенілгідразином (ДНФГ). В результаті цієї реакції утворюються динітрофенілгідразонові похідні, які поглинають світло з певною довжиною хвилі. Довжина хвилі, при якій спостерігається максимальне поглинання, залежить від сполуки, яка реагує з ДНФГ. Метод дозволяє визначати широкий спектр сполук, які містять карбонільну групу (див. роботу № 44). Така неспецифічність є, водночас, недоліком методу.

Реактиви.

Охолоджена 10% трихлороц­това кислота, 0,1% розчин 2,4-ди­нітрофенілгідразину (до 100 мг ДНФГ додають 100 мл розведеної (1:4) соляної кислоти, після чого фільтрують), толуол, 30% розчин КОН в 70% етиловому спирті.

Хід роботи.

Для аналізу взяти 1 мл досліджуваної рідини або тканину в кількості 0,8–1,0 г. Білки осади­ти дев’ятикратним об’ємом охо­лодженої 10% трихлороцтової кислоти. Суміш ретельно розтерти у порцеляновій ступці і центрифугувати при охолодженні протягом 10 хв при 5000 g. Надосадову рідину (супернатант) злити, і 0,5 мл перенести у пробірку. Контролем слугує 0,5 мл дистильованої води.

Для побудови калібрувального графіка приготувати п’ять проб з кінцевою кон­центрацією пірувату від 0,05 до 0,3 мкМ. У всі пробірки додати по 0,2 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину, перемішати і через 5 хвилин додати по 1,3 мл толуолу. Вміст пробірок струшувати протягом трьох хвилин. Суміш залишити відстоюватись для розшарування толуолу та води. З верхнього толуолового шару відібрати піпеткою 0,5 мл рідини і перенести у чисту пробірку. Додати 1,5 мл спиртового розчину КОН. Через 20 хв оптичну густину проб визначити на ФЕКу при довжині хвилі 465 нм проти кон­трольної проби.