Лабораторна робота № 13 Кількісне визначення глюкози і глікогену

Потрібно знати:

1) будову найрозповсюдженіших у живому світі полісахаридів – целюлози, крохмалю, глікогену, хітину, інуліну, агар-агару;

2) суть методів, на яких ґрунтується якісне і кількісне визначення глікогену та крохмалю;

3) роль глікогену в організмі тварин і грибів; шляхи його утворення та використання.

Потрібно вміти:

1) написати реакції, в результаті яких з глюкози і лактату утворюється глікоген (глюконеогенез);

2) написати хімічні реакції, які лежать в основі кількісного визначення глюкози.

Похідні вуглеводів типу фурфуролів, які утворюються при нагріванні глюкози з концентрованою сірчаною кислотою, дають з антроном забарвлені сполуки. За інтенсивністю забарвлення визначають кількість глюкози. Утворене забарвлення пропорційне кількості глюкози в діапазоні від 10 до 100 мкг глюкози в пробі.

Реактиви.

Антрон – 0,2% розчин, приготовлений на 95% розчині Н₂SO₄; розчин готують перед визначенням і ставлять на лід; стандартний розчин глюкози (0,5 г/л); 30% розчин КОН.

Хід роботи.

Роботу проводити у витяжній шафі!

1) Визначення глюкози. В широкі пробірки, які стоять у суміші лід-вода, налити по 2 мл досліджуваного розчину, який містить 25–200 мкг глюкози, і при струшуванні додати по 4 мл свіжоприготованого розчину антрону. Проби ретельно перемішати і поставити на водяну баню при 90°С. Через 10 хв проби охолодити до кімнатної температури, і утворене зелене забарвлення зі слабким синім відтінком фотометрувати при 620 нм (забарвлення стабільне при кімнатній температурі протягом кількох годин). Одночасно з досліджуваними розчинами поставити контрольну пробу з дистильованою водою і кілька проб з різними кількостями стандартного розчину глюкози для побудови калібрувального графіка.

Таблиця. Приготування проб для побудови калібрувального графіка

№ пробірки	Об’єм станд. розчину глюкози, мл	Об’єм води, мл	Об’єм розчину антрону, мл	Вміст глюкози у стандартному розчині, мкг	Оптична густина, D620 або D590
1 2 3 4 5	– 0,05 0,10 0,20 0,40	2,00 1,95 1,90 1,80 1,60	4 4 4 4 4	– 25 50 100 200

2) Визначення глікогену. Досліджувану пробу попередньо обробити лугом для руйну­вання простих цукрів. При високому вмісті глікогену в пробі визначення проводять “прямим” методом, тобто безпосередньо з розчину. Прямий метод застосовується для визначення глікогену в тканині печінки. Якщо вміст глікогену в пробі невисокий, то перед визначенням його осаджують спиртом – “непрямий метод”. В цьому випадку не­обхідне попереднє відокремлення глікогену, оскільки забарвлення з антроном дають також і продукти гідролізу білка, і при невеликих кількостях глікогену це впливає на результати визначення.

Прямий метод. В пробірки, які містять 1 мл гомогенату (25–100 мг тканини), додати по 3 мл 30% розчину КОН. Проби закрити корками і кип’ятити на водяній бані 20 хв. Після цього розчин охолодити до кімнатної температури, вміст пробірок кількісно перенести в мірні колбочки на 25–50 мл в залежності від вмісту глікогену в пробах (1 мл отриманого розчину повинен мати від 3 до 30 мкг глікогену) і об’єм довести водою до мітки. В широкі пробірки відібрати по 2 мл отриманого розчину, поставити їх на лід, додати при струшуванні 4 мл розчину антрону, ретельно пере­мішати, поставити на 10 хв на водяну баню при 90°С, потім охолодити і фотометрувати при 620 нм.

Паралельно з досліджуваними розчинами поставити контрольну пробу з дистильо­ваною водою і проби зі стандартними розчинами глюкози. Для розрахунку вмісту глікогену знайдену по калібрувальному графіку кількість глюкози (калібрувальний графік будується за глюкозою) помножити на коефіцієнт 0,9, оскільки молекулярна маса глюкозного залишку в глікогені дорівнює 162, а молекулярна маса глюкози – 180 (162 : 180 = 0,9).

“Непрямий метод”. В центрифужну пробірку внести 25-100 мг досліджуваної тка­нини, 1 мл гомогенату або безбілкового фільтрату, додати 3 мл 30% розчину КОН і кип’ятити на водяній бані протягом 20 хв. Потім проби охолодити, додати такий же об’єм (4 мл) спирту, добре перемішати скляною паличкою і кип’ятити на водяній бані. Коли суміш закипить, проби охолодити, і осад глікогену відділити центрифугуванням протягом 15 хв при 3000 об/хв. Супернатант обережно злити, осад глікогену розчинити в 1 мл дистильованої води і знову осадити таким же об’ємом спирту, нагріваючи пробу до кипіння на водяній бані. Осад глікогену відділити центрифугуванням, підсушити на повітрі, розчинити в 2 мл дистильованої води і провести колориметричне визначення, як вказано вище.