104

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ПРИКАРПАТСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ВАСИЛЯ СТЕФАНИКА

ІНСТИТУТ ПРИРОДНИЧИХ НАУК

КАФЕДРА БІОХІМІЇ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

ДО ЛАБОРАТОРНИХ ЗАНЯТЬ

З БІОХІМІЇ

для студентів ІІ-ІІІ курсів спеціальності “Біологія”

Друге видання, виправлене та доповнене

Івано-Франківськ

2006

Методичні вказівки склали: д.б.н. В.І. Лущак, к.б.н. Т.В. Багнюкова,

к.б.н. Г.М. Семчишин, к.б.н. Д.В. Господарьов

Затверджено на засіданні кафедри біохімії інституту природничих наук Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника

12 травня 2006 р. (протокол № 9).

Затверджено до друку вченою радою Інституту природничих наук (протокол № 6 від 29 травня 2006 р.)

Рецензенти:

Доцент кафедри біохімії Івано-Франківського державного медичного університету, кандидат біологічних наук Т.П. Максимчук

Професор кафедри біохімії інституту природничих наук Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника, доктор медичних наук І.В. Мазепа

 Прикарпатський університет ім. В. Стефаника, 2006

Вступ

Лабораторні заняття з курсу “Біохімія” виконуються відповідно до навчального плану підготовки бакалаврів, спеціалістів та магістрів біології денної та заочної форм навчання за спеціальністю 7.070402 (8.070402) – “Біологія”.

Мета проведення лабораторних занять з курсу “Біохімія” – поглибити теоретичні знання, отримані з лекційного курсу, дати основні навички роботи в біохімічній ла­бораторії, ознайомити з методами якісного та кількісного аналізу хімічного складу жи­вих організмів, принципами оцінки динаміки вмісту основних метаболітів, очистки та дослідження властивостей ферментів.

В результаті проведення лабораторних занять студенти повинні:

отримати знання про:

• правила техніки безпеки при роботі в біохімічній лабораторії.

• хімічний склад та основні класи сполук, які входять до складу живих організмів;

• основні метаболічні шляхи та регуляцію обміну вуглеводів, білків, нуклеїнових кис­лот та ліпідів;

• механізми регуляції активності ферментів, їх кінетичні характеристики;

навчитись:

• користуватись приладами біохімічної лабораторії;

• отримувати препарати для вивчення складу та функціонального стану організмів;

• визначати вміст білків, вітамінів, вуглеводів, нуклеотидів та жирів;

• досліджувати активність та регуляторні властивості ферментів;

• проводити математичну та статистичну обробки експериментальних даних;

• оформлювати результати лабораторних робіт;

• користуватись довідниками та каталогами.

Підготовка до лабораторного заняття включає теоретичне опрацювання матеріалу даної теми, знайомство з методикою виконання роботи та технікою безпеки. Принцип методу і хід роботи повинні бути записані в робочому зошиті до початку заняття. По закінченні практичної частини студенти захищають роботу у викладача. До захисту до­пускаються тільки повністю оформлені роботи. Оформлення передбачає занесення отриманих даних до таблиць, проведення необхідних розрахунків, відображення під­сумків роботи у вигляді висновку. Кожен етап обробки результатів роботи і проведен­ня розрахунків повинен бути коротко описаний, наприклад:

1) В ході роботи отримано наступні значення оптичної густини для стандартних і дослідних проб:

[ТАБЛИЦЯ]

2) За даними, наведеними в таблиці, будуємо калібрувальний графік:

[КАЛІБРУВАЛЬНИЙ ГРАФІК]

3) Згідно з калібрувальним графіком, вміст білка в дослідній пробі становить [значен­ня] мкг. Оскільки в пробу вносили [значення] мкл білкового розчину, то концентрація білка в пробі становитиме [розрахунок] = [значення] мкг/мкл = [значення] мг/мл.

4) Значення оптичної густини дослідної проби знаходиться в діапазоні лінійної залеж­ності оптичної густини від вмісту білка. Розрахуємо концентрацію білка за форму­лою: [розрахунок]= [значення] мкг/мкл = [значення] мг/мл.

Висновок. Концентрація білка в дослідній пробі становила [значення] мг/мл (якщо роз­раховувати за калібрувальним графіком), і [значення] мг/мл при розрахунку за форму­лою.

Абсолютно необхідним є наведення у формулах одиниць розмірності всіх величин, оскільки це дозволяє перевірити вірність розрахунків. У висновку повинні бути відо­бражені всі результати, отримані в роботі, і спостереження. У висновку не варто пода­вати теоретичний матеріал за темою роботи; повинна бути представлена інформація, отримана лише при виконанні даної лабораторної роботи. При оформленні роботи, зо­крема при написанні висновків, неприпустимі скорочення слів, окрім загальновжива­них – хв, мл, мг і т. п. Повністю оформленою вважається робота, в якій заповнені всі таблиці, наведені всі розрахунки і зроблений висновок з отриманих результатів.

Перелік абревіатур

АДФ	Аденозиндифосфорна кислота
АМФ	Аденозинмонофосфорна кислота
АТФ	Аденозинтрифосфорна кислота
АФК	Активовані форми кисню
GSH	Глутатіон відновлений
GSSG	Глутатіон окислений
ДНК	Дезоксирибонуклеїнова кислота
ДНФГ	2,4-Динітрофенілгідразин
ДТНБ	5,5′-Дитіобіс(2-нітробензойна) кислота
ДФА	Диметилформамід
ДХФІФ	2,6-Дихлорфеноліндофенол
ЕДТА	Етилендиамінтетраоцтова кислота
КФБ	Калійфосфатний буфер
ЛДГ	Лактатдегідрогеназа
NAD / NADH	Нікотинамідаденіндинуклеотид: окислений / відновлений
NADP / NADPH	Нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат: окислений / відновлений
ПОЛ	Перекисне окислення ліпідів
РНК	Рибонуклеїнова кислота
СОД	Супероксиддисмутаза
ТБК	2-тіобарбітурова кислота
ТЕМЕД	N,N,N′,N′-тетраметилетилендиамін
Трис	Трисметил-(гідрокси)-амінометан
ТХО	Трихлороцтова кислота
FAD / FADH2	Флавінаденіндинуклеотид: окислений / відновлений
ФЕК	Фотоелектроколориметр
FMN / FMNH2	Флавінмононуклеотид: окислений / відновлений
ФМСФ	Фенілметилсульфонілфторид
ФФК	Фосфофруктокіназа
ХДНБ	1-хлоро-2,4-динітробензен

І. Білки

Лабораторна робота № 1 Якісні реакції на білки

Потрібно знати:

1) хімічну природу білків;

2) хімічну структуру та властивості амінокислот, які входять до складу білків, та їхню класифікацію: а) за зарядом, б) за кількістю аміно- та карбоксильних груп, в) за роз­чинністю у воді (гідрофільні і гідрофобні амінокислоти);

3) методи ідентифікації С- та N-термінальних амінокислот.

Потрібно вміти:

1) написати формулу трипептиду будь-якого амінокислотного складу;

2) написати рівняння всіх хімічних перетворень, які відбуваються в біуретовій, ксанто­протеїновій, нінгідриновій реакціях, реакціях Фоля та Адамкевича.

Присутність білків у біологічних об’єктах можна виявити за допомогою кольорових реакцій, зумовлених наявністю амінокислот в білках, їх специфічними групами або пе­птидними зв’язками.

Існують універсальні кольорові реакції, характерні для всіх білків незалежно від амінокислотного складу (біуретова, нінгідринова), а також специфічні реакції, у яких беруть участь тільки певні амінокислоти молекули білка (ксантопротеїнова, Міллона, Фоля та ін.).

1. Біуретова реакція

В лужному середовищі, за присутності іонів міді (ІІ), розчини білків набувають фі­олетового забарвлення з червоним або синім відтінками, що залежить від концентрації пептидних зв’язків у розчині. Червонувате забарвлення дають продукти неповного гід­ролізу білків – пептони. Позитивну біуретову реакцію можуть давати речовини, які міс­тять у молекулі не менше двох пептидних зв’язків, а також окремі амінокислоти, на­приклад, гістидин. Біуретова реакція зумовлена наявністю пептидних зв’язків, які у лужному середовищі утворюють із сульфатом міді забарвлені комплекси:

Група, яка бере участь в утворенні пептидного зв’язку, в лужному середовищі знаходиться в тау­томерній енольній формі (див. малюнок). При надлишку лугу відбувається дисоціація ОН-групи, з’являється негативний заряд, за рахунок чого ки­сень взаємодіє з міддю, утворюючи солеподібні зв’язки. Мідь також утворює координаційні зв’яз­ки з атомами азоту пептидного зв’язку. Утворений комплекс стабільний. Інтенсивність забарвлення залежить від концентрації білка і кількості суль­фату міді в розчині.

Реактиви.

10% розчин NaOH, 1% розчин CuSO₄, 10% розчин яєчного білка (для збільшення розчинності яєчного білка в дистильованій воді її підлужнюють розчином NaOH).

Хід роботи.

В пробірку налити 1 мл 10% розчину яєчного білка, додати 2 мл 10% NaOH і 0,2 мл 1% розчину сульфату міді (ІІ). Результати спостережень занести до таблиці.

2. Нінгідринова реакція

Ця реакція властива як для вільних α-амінокислот, так і тих, які входять до складу білків та поліпептидів. При кип’ятінні білка з розчином нінгідрину (трикетогідринден­гідрат), амінокислоти окислюються з утворенням вуглекислого газу, аміаку і альдегіду. Нінгідрин при цьому відновлюється. Відновлений нінгідрин конденсується з аміаком і молекулою окисленого нінгідрину, утворюючи сполуку синьо-фіолетового кольору:

Реактиви.

0,5% розчин нінгідрину, 10% розчин яєчного білка.

Хід роботи.

В пробірку внести 1 мл 10% розчину білка і додати 1 мл 0,5% розчину нінгідрину. Суміш кип’ятити 1–2 хвилини. В пробірці поступово з’явиться рожеве, червоне, а потім синьо-фіолетове забарвлення. Результати спостережень занести до таблиці.

3. Ксантопротеїнова реакція

Ц я реакція є специфічною на ароматичні амінокислоти: три­птофан, фенілаланін, тирозин. При обробці білків концентро­ваною азотною кислотою білок спочатку випадає в осад, а при нагріванні розчиняється. Після цього розчин набуває жовтого кольору, який після додавання лугу переходить в оранжевий.

Реактиви.

10% розчин NaOH, HNO₃ (концентрована), 2% розчин яєчного білка.

Хід роботи.

Роботу проводити у витяжній шафі! В пробірку внести 1 мл розчину яєчного біл­ка, додати 0,5 мл концентрованої азотної кислоти і обережно нагріти. З’явиться лимон­но-жовте забарвлення. Після охолодження в пробірку внести 2 мл гідроксиду натрію. Забарвлення зміниться з жовтого на оранжеве. Результати спостережень занести до таблиці.

4) Реакція Фоля

Ця реакція так само, як і ксантопротеїнова залежить від наявності певних аміно­кислот в молекулах білків. Її принцип полягає в тому, що сірковмісні амінокислоти (цистин, цистеїн та метіонін) білків при нагріванні в присутності NaOH руйнуються з утворенням сірчистого натрію:

Сірчистий натрій реагує з ацетатом свинцю з утворенням чорного осаду сульфіду свинцю:

Реактиви.

1% розчин яєчного білка, 1% розчин желатини, 5% розчин ацетату свинцю, 30% розчин NaOH.

Хід роботи.

В першу пробірку налити 1 мл 1% розчину яєчного білка, а в другу – 1 мл 1% роз­чину желатини. Потім в обидві пробірки додати по 1 мл розчину гідроксиду натрію і по одній краплі 5% розчину ацетату свинцю. Нагрівати впродовж трьох хвилин. Результа­ти спостережень занести в таблицю.

5) Реакція Адамкевича

Принцип реакції полягає в тому, що амінокислота триптофан, яка міститься в білку, в кислому середовищі взаємодіє з альдегідами або альдегідокислотами з утворенням забарвлених продуктів конденсації. Інтенсивність забарвлення залежить від кількості триптофану в білках. Концентрована сірчана кислота бере участь у реакції як гігро­скопічна речовина.

Реактиви.

1 % розчин яєчного білка, 10% розчин желатини, 5% роз­чин сахарози, оцтова кислота, сірчана кислота.

Хід роботи.

Роботу проводити у ви­тяжній шафі! В першу і другу пробірки налити по 1 мл 1% розчину яєчного білка, в третю – 1 мл 1% розчину желатини. Потім у першу пробірку додати 1 мл 5% розчину сахарози, в другу і третю пробірки – по 1 мл концентрованої оцтової кис­лоти. Розчини спочатку нагріти, потім охолодити і, нахиливши пробір­ки, в кожну з них обережно по стінках влити по 2 мл концен­трованої сірчаної кислоти так, щоб рідини не змішувались. Помістити пробірки в киплячу водяну баню. Результати спостережень занести до таблиці:

Назва реакції	Досліджуваний матеріал	Реактиви	Забарвлення	Чим зумовлена реакція