3.4. Потенциометрические биосенсоры

К данной группе относят специальные устройства, которые состоят из индикаторного электрода и соединенного с ним гидрофильного слоя, содержащего биокатализатор (ферменты, бактерии, грибы, ткани растений и животных и т.п.). Многие биосенсоры содержат еще и полупроницаемую мембрану. Принцип их действия основан на диффузии определяемого вещества в тонкий слой биокатализатора, в котором протекает индикаторная реакция. При этом определяемое вещество (хотя и не всегда) превращается в форму, пригодную для регистрации потенциометрического сигнала. В качестве биокатализаторов обычно используют ферменты.

Если индикаторная реакция катализируется ферментами, то такие электрохимические системы называют ферментными электродами. По номенклатуре ИЮПАК ферментный электрод определяется как датчик «в котором ионоселективный электрод покрыт слоем, содержащим фермент, вызывающий реакцию органического или неорганического вещества (субстрата) с образованием веществ (ионов, молекул), обусловливающих отклик электрода». В настоящее время понятие «ферментный электрод» несколько расширилось, так как в него включают электрохимические системы с ферментом, закрепленным не только на чувствительном элементе ионоселективного электрода, но и на носителе, расположенном на некотором расстоянии от него или даже в растворе. В первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности электрода или в непосредственной близости от него.

Применение ферментов - уникальных биологических катализаторов - для создания потенциометрических датчиков определяется их высокой селективностью. Каждый фермент катализирует только один тип реакций (групповая специфичность) или вообще только одну единственную реакцию (субстратная специфичность). Каталитическая активность фермента максимальна для определенных условий среды: значений рН, температуры, химического состава. Рассматривая ферменты как специфические химические преобразователи, переводящие определяемое вещество в форму, детектируемую электродом, удалось разработать новый класс биосенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. В частности, в медицине нашли применение глюкозные и лактатные электроды для контроля состава крови. Многообещающее будущее имеют ферментные микроэлектроды. Трудно представить себе более надежный и изящный метод определения клеточных метаболитов.

Первый ферментный электрод, чувствительный к глюкозе, был разработан Кларком в 1962 г, который поместил между мембранами электрода глюкозоксидазу. Образующийся в результате реакции пероксид водорода определяли амперометрически.

Позднее Гилболт предложил электрод потенциометрического типа для определения мочевины, реакция разложения которой до иона аммония катализируется уреазой, иммобилизованной в объеме полимера на поверхности стеклянного электрода, чувствительного к однозарядным ионам.

В настоящее время в ферментных электродах в качестве электрохимических датчиков применяют платиновые, серебряные, графитовые, различные ионоселективные и газочувствительные электроды. При контакте фермента с исследуемым веществом в приэлектродном слое происходит ферментативная реакция.

Стабильность показаний ферментных электродов зависит от времени жизни ферментов. При этом ферменты могут подвергаться различным превращениям. Для продления периода их активного действия применяют так называемую иммобилизацию.

Разработаны самые разные ферментные электроды. Они различаются по характеру ферментативной реакции, по природе субстрата или фермента, по типу электрохимической реакции. При всем разнообразии протекающих на электроде процессов можно выделить следующие основные типы реакций, приводящих к изменению потенциала ферментного электрода:

реакции с образованием Н₂О₂;

реакции, сопровождающиеся изменением рН среды;

реакции с выделением СО₂ или NH₃;

реакции с образованием NH₄⁺, CN^- или других ионов;

реакции с образованием обратимой редокс-пары, например, I₂/I^- или хинон/гидрохинон.

Среди потенциометрических ферментных электродов наибольшее распространение получили электроды для определения мочевины (диагностический показатель функции печени). В качестве базового электрода применяют стеклянный электрод, чувствительный к ионам аммония.

В одной из конструкций ферментного электрода для определения глюкозы в качестве чувствительного элемента применяют стеклянный рН-электрод, регистрирующий изменение концентрации глюконовой кислоты, образующейся в результате ферментативной реакции

Глюктаоксидаза (над стрелкой)

Глюкоза + O₂ + Н₂O ↔ Глюконовая + Н₂O₂.

кислота

Предложены электроды для определения суммы некоторых аминокислот (тирозин, фенилаланин, триптофан, метионин) в крови, поскольку их содержание является важным диагностическим показателем в клинических анализах.

Еще один важный электрод - пенициллиновый, широко применяется для контроля за содержанием пенициллина в бродильных средах. Он представляет собой рН-электрод, покрытый иммобилизованной пенициллиназой. Электрод характеризуется небольшим временем отклика (< 30 с). Наклон градуировочного графика составляет 52 мВ в диапазоне концентрации 5 · 10^-2 – 10^-4 моль/л.

Разработаны ферментные электроды на основе редокс-систем. Они отличаются от ферментных электродов с ионоселективными чувствительными элементами природой электрохимических реакций, протекающих на электроде.

Применяются также потенциометрические бактериальные электроды. В электродах данного типа обычно используются газочувствительные электроды. При этом между индикаторным электродом и мембраной помещают слой бактерий, под действием которых определяемое вещество превращается в газообразный продукт, к которому чувствителен электрод.