Классификация приборных методов.

Четкой системы классификации приборных методов нет. Условно приборные методы работы с биологическими объектами могут быть разделены на различные группы, в зависимости от критерия:

1. В зависимости от того, расположены ли чувствительные элементы прибора непосредственно на объекте, или находятся от него на некотором расстоянии, методы подразделяются на контактные и дистантные. Пример – термометр и тепловизор

2. По характеру получаемой величины методы традиционно делятся на качественные, полуколичественные и количественные.

При использовании качественных методов исследователь получает информацию только о наличии или отсутствии у объекта какого либо свойства, вещества (тест-методы и тест-системы), процесса и т.д.

Используя полуколичественные методы, исследователь получает возможность сравнения данного объекта с другими, по интенсивности какого либо процесса или по содержанию каких-либо веществ, если оно выражено не в численном виде, а например в виде цветовой шкалы. То есть при использовании данных методов исследователь получает возможность сравнения нескольких объектов путем ответа на вопросы «больше или меньше, быстрее или медленнее». Но при этом, результаты не могут быть выражены в каких то конкретных единицах измерения. Пример – регистрация показателя среды при помощи индикаторной бумаги.

Наиболее предпочтительными и широко используемыми методами считаются количественные т.к. при этом появляется возможность изучения свойств объектов на основе абсолютных значений величин, преобразование и статистическая обработка результатов и т.д. Пример – весовые, концентрационные и многие другие измерения.

3. По соответствию исследуемой и измеряемой величин приборные методы подразделяются на прямые и косвенные.

В отличие от прямых, косвенные методы основаны на измерении каких либо сопутствующих величин, так или иначе связанных с исследуемой. Поэтому при интерпретации результатов такого рода исследований всегда используются аллометрические показатели. Пример – концентрационные исследования, фотометрические исследования, ВЭЖХ.

4. С точки зрения возможности использования оборудования в тех или иных условиях приборные методы подразделяются на лабораторные (как правило используется стационарное оборудование, приборы питаются от сети переменного натряжения) и полевые ( используется автономное переносное оборудование, либо оборудование, установленное на различных транспортных средствах, оборудование получает электропитание от собственных аккумуляторных батарей или от бортовой сети автомобиля, в котором оно расположено). В силу большей сложности, более высокого класса точности и более стабильных условий измерения результаты, полученные на лабораторном оборудовании, как правило, будут точнее аналогичных результатов, полученных в полевых условиях.

5. По последствиям для исследуемого живого объекта методы получения у него численных показателей можно разделить на прижизненные и деструктивные. Прижизненные методы изучения не наносят заметного вреда жизни и здоровью изучаемого объекта и поэтому являются более предпочтительными. К этой категории можно отнести большую часть весовых и морфометрических методов, подсчет численности особей, анализ крови животных и т.д. Деструктивные методы либо сами в значительной мере наносят ощутимый вред организму либо напрямую связаны с его умерщвлением. Применяются они в тех случаях, когда иначе интересующие исследователя показатели не могут быть получены. Примеры: методы анализа химического состава организмов и их анатомические исследования, пищевого рациона животных, определение показателей токсичности для различных химических веществ, исследование эффективности лекарственных препаратов и т.д.

При исследовании живых объектов чрезвычайно важной проблемой является обеспечение их максимальной, насколько это возможно, интактности. Этот термин означает стремление свести к нулю все возможные отрицательные для живых систем последствия, связанные с их исследованием. Он включает в себя: 1) минимизацию стресса, испытываемого живыми системами при их исследовании, 2) максимальное сходство условий эксперимента с естественными условиями обитания объектов. Иначе исследуемый объект, находясь в состоянии стресса, будет демонстрировать исследователю показатели, отличающиеся от его же показателей в «нормальном» состоянии – концентрацию гормонов, темп сердцебиения, интенсивность транспирации и т.д. А в том случае, если получение экспериментальных данных связано с умерщвлением и разрушением живых структур, искажения в полученных результатов могут возрастать многократно.

Особенно это касается растительных объектов в связи с высокой пластичностью их метаболизма. Растительные объекты (как и любые другие живые системы) воспринимают абиогенные факторы окружающей среды через множество различных каналов воздействия: освещение, температура, водный статус, газовый состав, химический состав окружающей среды, механические воздействия, радиационный фон и т.д. При этом картина взаимодействия особенно растительного объекта с окружающей средой чрезвычайно сложна.

При этом дополнительные трудности возникают, если используются деструктивные в той или иной степени методы исследования растений, связанные, например, с экстракцией из них различных веществ, так как при этом на общую картину состояния объекта как правило накладываются:

• неизбежные искажения условий, окружающих исследуемый объект, вызванные использованием измерительной аппаратуры.

• последствия произошедших, или происходящих в нем патологических процессов. Такие процессы обязательно связаны с нарушением гомеостаза организма или отдельных его частей (увяданием, разрушением клеточных мембран, изменениями гормонального статуса и т.д.). При этом иногда даже возникают трудности с определением того, что является причиной наблюдаемых у растительного объекта явлений: процессы, характерные для него в естественных условиях, или постепенно развивающиеся патологические процессы.

В этих условиях особое значение приобретает соблюдение чистоты эксперимента - исследователь должен быть уверен в том, что:

• условия эксперимента в достаточной степени стандартизированы;

• последствия неизбежного отхода от естественных условий обитания, вызванного применением измерительного оборудования, минимальны и хорошо прогнозируемы;

• динамика изменяемых параметров задается и регулируется исследователем.

При приборном исследовании интактных растительных объектов также практически всегда в той или иной степени происходит нарушение условий окружающей исследуемое растение среды. В частности, это происходит при использовании контактных приборных методов, связанных с прикреплением к растению различных датчиков, что изменяет гормональный статус растения в сторону возрастания гормонов стресса. Однако, в силу того, что исследуемый объект не разрушается, общая достоверность результатов эксперимента в этом случае значительно выше, чем в случае использования деструктивных методов исследования биологических объектов.

Морфометрия- измерение различных морфологических показателей;

Весовые измерения – суточная динамика накопления организмами биомассы,

Измерение концентрации, качественного и количественного состава растворов – Ионселективная потенциометрия, кондуктометрия, полярография, спектрофотометрия, фотоэлектроколориметрия;

Исследование газообмена – Газовая хроматография

Другие хроматографические методы – тонкослойная хроматография и ВЭЖХ

Измерение концентрации, качественного и количественного состава растворов .

Кондуктометрия.

. Кондуктометрический метод.

Под термином «кондуктометрия» обычно понимается целая группа родственных методов (прямая и косвенная кондуктометрия, кондуктометрическое титрование и т.д.), основанных на измерении проводимости (или сопротивления) исследуемого раствора. Большая часть этих методов известны еще с 50-х годов 20 в. и широко применяются в научных исследованиях, при проведении различных видов химического анализа, а также – в промышленности (например – на очистных сооружениях, для определения качества воды). В физиологии растений может быть с успехом применен метод, называемый «прямая кондуктометрия». К сожалению, он применим для отслеживания динамики только общего потребления ЭМП, поскольку используемая аппаратура не обладает селективностью, т.е. неспособна различать отдельные группы катионов и анионов. Однако, метод обладает высокой чувствительностью в диапазоне (10^-3 – 10^-5 М/л).

Оборудование. В комплект оборудования для прямой кондуктометрии входит стандартная кондуктометрическая ячейка и непосредственно сам измерительный прибор. При исследовании раствор помещается во внутренний объем ячейки, который представляет собой кубическую полость со стороной 1 см. В две боковые противоположно расположенные грани этой кубической полости вмонтированы квадратные платиновые электроды, площадью 1 кв.см. каждый. Возможны также варианты экспериментов, в которых вместо стандартной ячейки используются выносные электроды. В этом случае появляется возможность отслеживать мгновенные значения потребления ЭМП. Измерительный прибор представляет собой стандартный мост переменного тока (например, серии Р-5010).

Принцип метода. Согласно современным представлениям, проводимость водных растворов определяется следующими факторами:

1. Наличием частиц - переносчиков заряда. В качестве таких частиц выступают, в первую очередь, различные ионы, и в гораздо меньшей степени – недиссоциированные молекулы растворенных в воде органических веществ.

2. Подвижностью частиц – носителей заряда в водном растворе. Этот показатель зависит в первую очередь от концентрации раствора и от его температуры.

3. Общим количеством частиц- переносчиков заряда. Этот параметр зависит от концентрации раствора, а для слаборастворимых соединений и растворов высокой концентрации – еще и от степени их диссоциации.

Таким образом при кондуктометрическом исследовании растворов наблюдается следующая картина: дистиллированная вода характеризуется максимальным значением сопротивления (порядок величин – 10⁵ Ом) и минимальным – проводимости в силу того, что в ней всегда присутствуют ионы Н⁺ и ОН^- . При постепенном увеличении концентрации солей общее сопротивление раствора быстро снижается на несколько порядков и достигает минимума при общей концентрации примерно 0,5 М/л (порядок величин – 10^-1 Ом). При дальнейшем насыщении раствора, его сопротивление снова начинает возрастать, в силу того, что снижается подвижность ионов.

Оценка концентрации исследуемого раствора производится при помощи калибровочного графика. Поскольку зависимость показаний прибора от концентрации раствора носит явно выраженный нелинейный характер, калибровочный график необходимо строить на основании 6-7 точек, расположенных в интересующем исследователя диапазоне концентраций. Необходимо отметить, что в отличие от описанного ниже потенциометрического метода исследования растворов, аппаратура, используемая для кондуктометрии, не содержит элементы, имеющие заведомо «плавающие» показатели. Поэтому единожды построенной калибровочной кривой можно пользоваться на протяжении нескольких месяцев. В силу того, что особенно на малых концентрациях метод обладает высокой чувствительностью, необходимо тщательно следить за чистотой ячейки. В качестве способа контроля чистоты ячейки можно порекомендовать снятие показаний проводимости при заполнении ячейки дистиллированной водой. Кроме того, необходимо отслеживать и стандартизировать температуру исследуемых растворов.

При отсутствии стандартной электрохимической ячейки ее функции может выполнить стеклянная химическая посуда небольшого объема, в которую погружаются выносные платиновые электроды. При этом, кроме температуры необходимо стандартизировать следующие параметры:

• Линейные геометрические размеры ячейки. Идеальной ситуацией является использование одной и той же посуды на протяжении всей серии экспериментов.

• Количество исследуемого раствора. Фактически количество исследуемого раствора определяет его линейные размеры и в частности – площадь поперечного сечения раствора как проводника. Превышение количества исследуемого раствора в 2 раза при прочих равных условиях может привести к ошибке в 20%.

• Площадь электродов, их ориентацию относительно друг друга и исследуемого раствора.

В отличие от измерения сопротивления радиодеталей, измерение сопротивления (или проводимости) водных растворов проводится при переменном напряжении. Частота, при которой производится измерение показателей проводимости растворов, автоматически подбирается прибором, и может варьировать в диапазоне 1-10 Кгц. Необходимость в использовании переменного напряжения вызвана тем, что при постоянном напряжении на электродах начинают происходить явления, характерные для электролиза – осаждение отдельных ионов окислов и гидроокислов, выделение газов и т.д. В результате всего вышесказанного значительно искажаются результаты измерений