17. Микроорганизмы как объекты генетических исследований. Организация генетического аппарата у бактерий и методы генанализа.

Развитие молекулярной генетики явилось мощным стимулом для исследований, посвященных изучению молекулярно-генетических основ патогенности и иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиотико-резистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Последние, являясь мощными селективными факторами, способствуют накоплению предшествующих в популяции резистентных форм бактерий и формированию лекарственно-устойчивых популяций с измененными патогенными и другими свойствами.

Вместе с тем изменения иммунологической реактивности макроорганизма в результате разнообразных воздействий факторов окружающей среды, а также всевозможных лекарственных препаратов оказывают существенное влияние на фенотипическое выражение патогенных генотипов. Все это отражается на наблюдаемых в настоящее время изменениях в патогенетических и клинических особенно инфекционных заболеваний и распространении внутрибольничных инфекций.

Достижения генной инженерии позволяют создать новые генетические элементы из нуклеотидных последовательностей, несущие заданию информацию, способы их переноса в клетки про- и эукариотов. Новые генетические элементы представляют собой рекомбинантные молекулы ДНК, которые включают два компонента: вектор-переносчик и клонированную «чужердную» ДНК. Вектор должен обладать свойствами репликации обеспечить репликацию вновь созданной рекомбинантной молы. Поэтому в качестве вектора используют такие репликоны, как змиды, умеренные фаги, вирусы животных, имеющие циркулярнуюI замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК - это фрагмент ДНК, несущий необходимый ген, контролирующий синтез нужного продукта. В настоящее время разработаны различные технологические приемы создания рекомбинантных молекул. Наиболее простой принцип сводится к обработке выделенных молекул ДНК вектора и ДНК, несущей нужный ген, ферментами рестриктазами (эндонуклеазы рестрикции), атакующими взятые молекулы ДНК в строго определеном участке. Некоторые рестриктазы расщепляют молекулы ДНК бразованием однонитевых комплементарных друг другу концов, называемых «липких» концов. Таким образом, первым этапом является «разрезание» молекул ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции. Второй этап состоит в обработке полученных линейных молекул ферментом полинуклеотидлигазой, которая «сшивает» две разные молекулы в одну рекомбинантную, третий - во введении рекомбинантных молекул методом трансформации в клетки Е. coli или других микроорганизмов, например дрожжей.

Гены, необходимые для жизнедеятельности и определяющие видовую специфичность, расположены у бактерий чаще всего в единственной ковалентно замкнутой молекуле ДНК — хромосоме (иногда для обозначения бактериальных хромосом, чтобы подчеркнуть их отличия от эукариотических, используют термин генофор (англ. genophore)). Область, где локализована хромосома, называется нуклеоид и не окружена мембраной. В связи с этим новосинтезированная мРНК сразу доступна для связывания с рибосомами, а транскрипция и трансляция сопряжены.

Отдельная клетка может содержать лишь 80 % от суммы генов, имеющихся во всех штаммах её вида (т. н. «коллективный геном»).

Помимо хромосомы, в клетках бактерий часто находятся плазмиды — также замкнутые в кольцо ДНК, способные к независимой репликации. Они могут быть настолько велики, что становятся неотличимы от хромосомы, но содержат дополнительные гены, необходимые лишь в специфических условиях. Специальные механизмы распределения обеспечивают сохранение плазмиды в дочерних клетках так что они теряются с частотой менее 10⁻⁷ в пересчёте на клеточный цикл. Специфичность плазмид может быть весьма разнообразной: от одного вида-хозяина до плазмиды RP4, встречающейся почти у всех грамотрицательных бактерий. В них кодируются механизмы устойчивости к антибиотикам, разрушения специфических веществ и т. д., nif-гены, необходимые для азотфиксации также находятся в плазмидах. Ген плазмиды может включаться в хромосому с частотой около 10⁻⁴ — 10⁻⁷.

В ДНК бактерий, как и в ДНК других организмов, выделяются транспозоны — мобильные сегменты, способные перемещаться из одной части хромосомы к другой, или во внехромосомные ДНК (в том числе в другие клетки). В отличие от плазмид, они неспособны к автономной репликации, и содержат IS-сегменты — участки, которые кодируют свой перенос внутри клетки. IS-сегмент может выступать в роли отдельной транспозоны.

У прокариот может происходить частичное объединение геномов. При конъюгации клетка-донор в ходе непосредственного контакта передаёт клетке-реципиенту часть своего генома (в некоторых случаях весь). Участки ДНК донора могут обмениваться на гомологичные участки ДНК реципиента. Вероятность такого обмена значима только для бактерий одного вида.

Аналогично бактериальная клетка может поглощать и свободно находящуюся в среде ДНК, включая её в свой геном в случае высокой степени гомологии с собственной ДНК. Данный процесс носит название трансформация. В природных условиях протекает обмен генетической информацией при помощи умеренных фагов (трансдукция). Кроме этого, возможен перенос нехромосомных генов при помощи плазмид определённого типа, кодирующих этот процесс, процесс обмена другими плазмидами и передачи транспозон.

При горизонтальном переносе новых генов не образуется (как то имеет место при мутациях), однако осуществляется создание разных генных сочетаний. Это важно по той причине, что естественный отбор действует на всю совокупность признаков организма.