2. Материалы и методы исследований

Материалами для исследования явился 51 образец крови здоровых доноров (42 женщины и 9 мужчин) в качестве контроля, 44 образцов больных раком толстого кишечника (26 женщин и 18 мужчин), предоставленные клиникой Областного онкологического центра, 35 образцов крови больных герпесвирусной инфекцией инфекцией (14 женщин и 21 мужчина), предоставленные инфекционной больницей №2 г. Нижнего Новгорода.

2.1 Ферменты и биопрепараты

Дезоксинуклеозидтрифосфаты в растворе – смесь 4-х дНТФ, по 2 мМ каждого из дНТФ (Fermentas, Латвия); Taq – ДНК полимераза, укомплектованная 10Xбуфером (ООО «Генные и клеточные технологии», Россия, Н.Новгород); M-MuLV обратная транскриптаза, укомплектованная 5Xбуфером (Promega, США).

2. Выделение тотальной рнк (Chomczynski et al., 1987)

Образцы периферической крови здоровых доноров были помещены в пластиковую пробирку (типа «Eppendorf») и подвергались лизированию. К 200 мкл лизирующего раствора (6М ГИТЦ, 1% Тритон X100, 100мМ ацетат Na, pH 7.0, 2% β-меркаптоэтанол) добавлялся такой же объем периферической крови и перемешивался. Затем добавлялось 200 мкл смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1/1 pH 5.0). Смесь интенсивно перемешивалась на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия). Для разделения фракций проба центрифугировалась на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 14.5 тыс. об./мин в течение 15 минут. 200 мкл водной фазы отбиралось в чистую пробирку, депротеинизированная РНК преципитировалась 200 мкл изопропилового спирта (20-60 минут при -20˚С). РНК осаждали центрифугированием на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 15 тыс об./мин в течение 20 минут. Осадок промывался 800 мкл 75% этанола, центрифугировался 5 минут и сушился при комнатной температуре (или при 60˚C в термостате) до исчезновения запаха спирта. Очищенная РНК ресуспендировалась в 20 мкл деионизированной воды, свободной от РНКаз и хранилась в холодильнике при -20˚C до использования (не более 2 недель)

2. Полимеразная цепная реакция (Дейвис, 1990)

Для проведения ПЦР готовили необходимое количество реакционной смеси для анализа необходимого числа проб в пропорциях, представленных в таблице 1. Для устранения погрешности, вносимой дозаторами при смешивании микрообъемов, общую смесь готовили из расчета на одну пробу больше, чем необходимо.

Таблица 1

Состав реакционной смеси для проведения ПЦР

Количество проб	1	2	3	4	5
10XБуфер (мкл)	2,5	5	7,5	10	12,5
dNTP(мкл)	2	4	6	8	10
F-праймер (GR-20)(мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5
Tag-pol(мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5
2d H2O(мкл)	17	34	51	68	85
R-праймер (Fas-OF) (мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5

Смесь тщательно перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин.

В маркированные пробирки объемом 0.5 мл вносили по 23 мкл полученной реакционной смеси и по 2 мкл ДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Компоненты перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), смесь кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Для предотвращения испарения жидкости реакционную смесь покрывали двумя каплями минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе Fas Hot Start.

Условия инкубации реакционной смеси в амплификаторе «Терцик»:

для однонуклеотидного полиморфизма Fas -670 (A/G):

94ºС – 30с

65ºС – 30с 45 циклов

72ºС – 40с

для однонуклеотидного полиморфизма Fas -1377 (A/G):

9 4ºС – 30с

67,5ºС – 40с 45 циклов

72ºС – 30с

Для выявления полиморфизмов были использованы праймеры, нуклеотидная последовательность которых показана в таблицах 2 и 3. Также указана первичная структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas (таблица 4).

Таблица 2

Структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas, содержащего олигонуклеотидный полиморфизм Fas-670A\G

Праймеры	Нуклеотидная последовательность (5´-3´)
Fas ОНП F (A)	5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgA-3'
Fas ОНП F(G) alt	5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgg -3'
Fas ОНП R	5'-TggCATgCTCACTTCAggTg -3'

Таблица 3

Структура праймеров для амплификации промоторного участка гена Fas, содержащего олигонуклеотидный полиморфизм Fas-1377A\G

Праймеры	Нуклеотидная последовательность (5´-3´)
Fas ОНП 1377 F A)	5'-TgTgTgCACAAggCTggCACA -3'
Fas ОНП 1377 F(G)	5'-TgTgTgCACAAggCTggCACg -3'
Fas ОНП R	5'-TCTgCACCTCACTCTgCAACCT -3'

Таблица 4

Первичная структура праймеров для амплификации промоторного

участка гена Fas, содержащего олигонуклеотидный полиморфизм Fas-670A\G

Праймер	Нуклеотидная последовательность 5’- 3’
FasFp	AgTgTgTCCAgTCTggAACT
FasRp	CgAggTAACTAAgTCgTTgA

Результаты реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле.