ность процесса без привлечения ГТФ, а ее свойства в сравнении с таковыми факторзависимой (энзиматической) транслокации свидетельствуют о преимущественно энтропийном вкладе EF-G как катализатора.

6. ПЕРЕДВИЖЕНИЕ МАТРИЦЫ ПРИ ТРАНСЛОКАЦИИ

Уже отмечалось, что транслокация сопровождается перемещением матричного полинуклеотида на один кодон. В процессе этого сдвига и после него связь между антикодоном пептидил-тРНК и кодоном матрицы сохраняется; кодон-антикодоновый комплекс движется, повидимому, как целое из А-участка в Р-участок рибосомы.

Естественно поставить вопрос, что служит ведущим актом —пе- ремещение матрицы или перемещение пептидил-тРНК? Ряд фактов указывает на то, что ведущим является транслокационное перемещение тРНК, которая своим антикодоном тянет за собой кодон матрицы. В качестве одной из ярких демонстраций независимости транслокации от матричного полинуклеотида можно рассматривать открытие рибосомного синтеза полипептида из аминоацил-тРНК в отсутствие матричного полинуклеотида; в этом случае было показано существование нормального элонгационного цикла с EF-G • GTP-катализи- руемой транслокацией. Наиболее прямым указанием на ведущую роль

205

триплета, супрессировала мутацию со сдвигом рамки (+1), т. е. передвигала мРНК в рибосоме, соответственно, на четыре (а не на три) нуклеотидных остатка.

Таким образом, главное событие транслокации это, по-видимому, перемещение пептидил-тРНК из А-участка в Р-участок рибосомы. Антикодон тянет за собой связанный с ним кодон матрицы, приводя к соответствующему перемещению матрицы относительно рибосомы на один триплет (в норме). В результате в А-участке устанавливается следующий (по направлению к З'-концу) нуклеотидный триплет матрицы, а предыдущий (примыкающий с 5'-конца) триплет вместе с антикодоном деацилированной гРНК оказывается выведенным из Р-участка.

7. ЭНЕРГЕТИКА ТРАНСЛОКАЦИИ

Вопрос об энергетике транслокации долгое время был еильно запутан ввиду ряда исторических причин и из-за традиционности мышления биохимиков. Дело в том, что участие ГТФ в процессе транслокации стало известно раньше всех прочих фактов, касающихся этой стадии элонгационного цикла. Рассмотрение транслокации как процесса механического перемещения крупных молекулярных масс и факт сопряженного расщепления ГТФ на ГДФ и ортофосфат наводили на мысль об аналогии с мышечным сокращением, происходящим за счет энергии гидролиза АТФ до АДФ и ортофосфата. Это создало мощный психологический стимул для выдумывания особых энергетических проблем в процессе транслокации, которые должны бы были решаться за счет энергии расщепления ГТФ. Практически все предложенные с тех пор модели транслокации предполагают, что энергия именно EF-G-опосредованного гидролиза ГТФ так или иначе используется для механической работы по активному перемещению или хотя бы активному выталкиванию рибосомных лигандов (тРНК) из их связывающих участков, а фактору EF-G и/или белку L7/L12 часто приписывают функцию сократительных белков. Согласно одним моделям, энергия ГТФ через EF-G прилагается к пептидил-тРНК, занимающей А-участок, так что развиваемое усилие сдвигает ее вместе со своим кодоном по направлению к Р-участку, вытесняя деацилированную тРНК из Р-участка. В других моделях энергия ГТФ реализуется фактором EF-G первично для удаления (выталкивания) деацилированной тРНК из Р-участка, и тогда пептидилтРНК спонтанно переходит из А-участка в вакантный Р-участок, к которому она имеет большое сродство, увлекая с собой свой кодон матричного полинуклеотида.

Однако распад ГТФ, как уже указывалось, происходит после транслокации, т. е. никакого сопряжения реакции гидролиза ГТФ непосредственно с транслокацией нет. Кроме того, было показано, что в реакции гидролиза идет прямой перенос фосфатного остатка

206

от ГТФ на воду, без образования какого бы то ни было промежуточного фосфорилированного соединения, могущего обеспечить сопряжение. Следовательно, остается предполагать другой механизм: транслокация сопряжена с адсорбцией EF-G на рибосому, в то время как гидролиз ГТФ требуется для десорбции EF-G. Если бы действительно надо было совершать работу для перевода рибосомы из претранслокационного состояния в поеттранслокационное, то можно было бы считать, что работа совершается за счет энергии образования комплекса GTP • EF-G • рибосома, которая затем компенсируется энергией гидролиза ГТФ. Таким образом, этот механизм все равно обеспечивал бы работу в конечном счете энергией гидролиза ГТФ, но не путем ее прямого сопряжения, а путем «дачи взаймы» с последующим возвратом.

На самом деле, как было показано, транслокация может идти спонтанно, без EF-G и ГТФ (неэнзиматическая транслокация). Это значит, что процесс термодинамически разрешен (процесс «с горы») или, другими словами, термодинамический потенциал (свободная энергия) претранслокационного состояния рибосомы выше, чем поеттранслокационного состояния. Естественно, в такой ситуации затрата энергии для совершения работы (поднятия потенциала) не требуется. Таким образом, какой бы то ни было термодинамический вклад EF-G с ГТФ в процесс транслокации надо исключить.

Тем не менее, в EF-G-катализируемой транслокации EF-G с ГТФ к рибосоме присоединяются, и затем ГТФ гидролизуется, т. е. дополнительная свободная энергия тратится. На что? Очевидно, что любая энергия может затрачиваться либо для совершения полезной работы против термодинамического потенциала (проведение процесса «в гору»), либо на преодоление барьеров в спонтанном («с горы») процессе, без накопления полезной работы. Исключая первую альтернативу, остается признать, что вклад ГТФ является чисто кинетическим: сначала взаимодействие ГТФ с EF-G обеспечивает присоединение EF-G • GTP к рибосоме и тем самым уменьшение барьеров в ходе транслокации, а затем гидролиз ГТФ снимает барьер, создаваемый самим EF-G для следующей стадии элонгационного цикла. Следовательно, энергия ГТФ тратится только на преодоление барьеров и в конечном счете целиком диссипирует в теплоту. Это и есть катализ транслокации. В данном случае особенностью катализа является то,

с тем, имеющиеся знания о структуре тРНК и рибосомы, а также о свойствах претранслокационного и поеттранслокационного комплексов дают возможность предполагать вероятную стереохимическую модель взаимодействий между рибосомой, двумя тРНК и мРНК и изменение этих взаимодействий при транслокации. Такая гипотетическая модель излагается ниже.

207

Рис. 113. Схематическое изображение перехода (винтового перемещения) молекулы тРНК из А-участка в Р-участок рибосомы при транслокации. Для простоты изображения в претранслокационном состоянии рибосомы показан лишь один остаток тРНК (остаток пептидил-тРНК)

При рассмотрении стереохимии кодон-антикодонового взаимодействия в гл. В.П. 1 указывалось, что антикодоны двух тРНК образуют двуспиральные структуры типа А-формы с двумя смежными кодонами мРНК (см. рис. 94). З'-Концы двух тРНК также сближены, а углы разведены, так что плоскости двух тРНК находятся под определенным углом друг к другу (см. рис. 93). Эта ситуация сохраняется после транспептидации и, таким образом, претранслокационная рибосома содержит комплекс деацилированной тРНК (в Р-участке) и пептидилтРНК (в А-участке), скрепленный комплементарным гексапле-

тРНК, включающая поворот относительно оси, проходящей через антикодон и акцепторный конец, по часовой стрелке (если смотреть от антикодона) и трансляцию вдоль той же оси в направлении акцепторного конца. В результате деацилированная тРНК оказывается выведенной из Р-участка и диссоциирует из комплекса со своим кодоном; пептидил-тРНК оказывается в Р-участке, а угол ее тРНК располагается у основания L7 / Ы2-стержня; А-участок теперь вакантен. Это и есть посттранслокационное состояние (рис. 113).

Какая сила заставляет двигаться пептидил-тРНК из А-участка в Р-участок при транслокации? Если путь перемещения комплекса двух тРНК и мРНК задается конструкцией самой рибосомы, то само перемещение может быть результатом теплового движения. Поскольку перемещение сопровождается диссоциацией деацилированной тРНК, результат оказывается энтропийно выгодным. Во всяком случае, в бесфакторной (неэнзиматической) транслокации нет, по-видимому, другого источника движения, кроме теплового движения. Вероятно, что точно так же тепловое движение индуцирует перемещение в

208

процессе EF-G • GTP-катализируемой транслокации, но посадка EF-G с ГТФ на рибосому создает какую-то структурную обстановку, при которой стерические и энергетические барьеры на пути перехода оказываются сниженными (в том числе, под влиянием EF-G может снижаться сродство пептидил-тРНК к А-участку). Стержень L7/L12 рибосомы, по-видимому, каким-то образом участвует в механизме катализа транслокации (в создании благоприятной структурной обстановки) под влиянием фактора EF-G с ГТФ.

9.ПОДВЕДЕНИЕ ИТОГОВ: ОБЩИЙ МАТЕРИАЛЬНЫЙ

ИЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАЛАНС ЭЛОНГАЦИОННОГО ЦИКЛА

Итак, следующие друг за другом стадии кодоннаправляемого связывания аминоацил-тРНК с элонгирующей рибосомой, транспептидации и транслокации создают цикл, в результате которого а) детерминируется положение одного аминокислотного остатка в полипептидной цепи, подлежащей синтезу; б) образуется одна пептидная связь; в) деацилируется одна молекула аминоацил-тРНК; г) гидролизуются две молекулы ГТФ до ГДФ и ортофосфата и д) оказывается продвинутым относительно рибосомы (прочитанным) один нуклеотидный триплет матричного полинуклеотида. Повторение таких циклов и создает процесс элонгации; количество циклов на всю элонгацию определяется количеством кодирующих триплетов матрицы (за вычетом инициирующего кодона).

В чисто материальном выражении на один цикл потреблены из раствора одна молекула аминоацил-тРНК и две молекулы ГТФ (плюс две молекулы воды). Отданы в раствор одна молекула деацилированной тРНК, две молекулы ГДФ и две молекулы ортофосфорной кислоты (см. рис. 80). Одновременно в рибосоме произошло удлинение пептида.

Отсюда следует также и энергетический баланс цикла. Энергетические потребности цикла представляются весьма скромными: это детерминация положения аминокислотного остатка в полипептидной цепи, AG°%+ 10 кДж/моль (2,5 ккал/моль) и образование пептидной связи, AG°'**>+2 кДж/моль (+0,5 ккал/моль). Ясно, что эти энергетические потребности всего цикла с избытком покрываются той свободной энергией, которая освобождается при деацилировании аминоацил-тРНК, Д G0 ' « -30 кДж/моль (-7 ккал/моль). Тем не менее, сопряженно с циклом происходит гидролиз двух молекул ГТФ (см. рис. 80), дающий освобождение еще дополнительного большого количества свободной энергии, AG°' » -60 кДж/моль (-15 ккал/моль). Таким образом, элонгация выглядит процессом расточительным, мало экономичным, с низким коэффициентом полезного действия. Преобладающая часть свободной энергии, освобождаемой в ходе цикла, диссипирует в теплоту.

В то же время, при исключении ГТФ даже из одной стадии цикла (либо из стадии связывания аминоацил-тРНК, либо из стадии гранслокации) процесс резко замедляется, а кроме того, становится