5.2.1. Мутации, индуцированные радиацией

5.2.1.1. Основные факты и проблемы, поставленные в ходе их анализа

Способность радиации индуцировать мутации. То, что радиация может индуцировать мутации, предполагалось с давних пор, но первые доказательства в пользу этого предположения были получены Мёллером (1927) [1567] на Drosophila melanogaster и Стадлером (1927-1928) на ячмене. До этого Мавор (1924) обнаружил радиационную индукцию нерасхождения [1552]. Открытие Мёллера стало возможным благодаря разработке им метода для подсчета мутаций и особенно деталей, сцепленных с Х-хромосомой дрозофилы. Результаты классического эксперимента Мёллера приведены в табл. 5.24. В данном случае доза t₄ вдвое выше дозы t₂. Удвоение дозы облучения приводило к приблизительному удвоению числа индуцированных мутаций. Однако масштабы этого эксперимента слишком малы для того, чтобы можно было выявить спонтанные мутации в контроле.

В последующие два десятилетия происходило развитие классической радиационной генетики. Ее основные положения были изложены в книгах Ли и Кэтчсайда (1942) [1528], Тимофеева-Ресовского и Циммера (1947) [1656], Холландера [97] (1954-1956).

Несколько специальных замечаний о радиации. Следует рассмотреть два типа радиации высоких энергий: электромагнитные волны и корпускулярное излучение. Зависимость биологической активности электромагнитных волн от длины волны изображена на рис. 5.41. Для получения мутагенного эффекта необходимо, чтобы энергия радиации была по крайней мере достаточной для перемещения электрона с внутреннего на внешний уровень, переводящего атом в нестабильное состояние и увеличивающего его склонность к участию в химических реакциях. УФизлучение имеет подходящие для этого параметры и поэтому при воздействии на ДНК производит мутагенный эффект. Наиболее известная химическая реакция, вызываемая этим излуче-

Таблица 5.24. Результаты классического эксперимента Мёллера, в котором были получены доказательства индукции мутаций рентгеновскими лучами [1567]. (Доза t4 вдвое выше дозы t2.)
Опыт	Число обследованных хромосом	Число обнаруженных мутаций
		Летали	Полулетальные мутации	Визуально наблюдаемые мутации
Контроль	198	0	0	0
Х-лучи (t2)	676	49	4	1
Х-лучи (t4)	772	89	12	3

224 5. Мутации

Рис. 5.41. Зависимость биологической активности электромагнитных волн от их длины и энергии.

нием, - димеризация двух соседних молекул тимина. Она препятствует их спариванию с аденином Поэтому, хотя фотоны УФ-излучения и вызывают точковые мутации, они редко приводят к появлению структурных дефектов Для половых клеток человека УФ-лучи не опасны, так как они поглощаются эпидермисом Однако УФ-облучение может индуцировать соматические мутации в клетках кожи и вызывать рак кожи (разд. 5.1.6). Излучение фотонов высоких энергий (Х- и γ-лучей) может выбивать электроны с внешнего уровня, превращая атом в положительный ион Эти электроны в свою очередь могут взаимодействовать с другими атомами, превращая их в отрицательно заряженные ионы Ионы обоих типов вместе со свободными радикалами образуют материал для вторичных химических реакций. Корпускулярное излучение состоит не из фотонов высокой энергии, а из частиц. Они могут, подобно электронам и протонам, быть заряжены, а могут, подобно нейтронам, и не иметь заряда. Их физическое действие зависит от их кинетической энергии. Продукты ионизации, индуцированной нейтронами, плотно сконцентрированы вдоль трека частицы, тогда как электромагнитные волны (Х- и γ-излучение) производят менее плотную ионизацию.

Биологическое действие радиации всех типов зависит от локализации источника (внутри или вне организма), типа излучения (электромагнитные волны, заряженные или незаряженные частицы), энергии излучения и свойств (плотности, содержания воды и т. д.) поглощающего материала.

Облучение любого типа вызывает не только прямые, но и косвенные эффекты Например, нейтроны могут включаться в атомные ядра, а могут передавать свою кинетическую энергию, скажем, ядрам водорода (протонам) Эти протоны ускоряются и вступают во множество вторичных реакций с другими молекулами.

Дозу энергии излучения обычно измеряют в греях (Гр): 1 Гр равен дозе энергии, поглощаемой при передаче 1 Дж энергии ионизирующей радиации веществу массой 1 кг в определенных постоянных условиях. Она соответствует 100 радам (в старых единицах) и, как правило, 100 рентгенам (Р), однако последняя единица определяется через число ионов, возникающих при ионизации Другая важная мера радиации это эквивалентная доза, измеряющая (вредный) биологический эффект определенной дозы излучения. Она вычисляется путем умножения энергетической дозы на множитель, изменяющийся при изменении вида излучения в зависимости от особенностей процесса выделения энергии; например, при плотной ионизирующей радиации он больше, чем при рассеянной Она измеряется в Дж/кг (Дж джоуль). Старой единицей ее измерения является рэм (1 рэм = 1/100 Дж/ki). В этой книге часто цитируются данные, приводящиеся в старых работах. При этом мы используем новую систему единиц, принимая, что 1 Гр = 100 мГр = 100 рад = 100 Р. Возможно, это не всегда будет удовлетворять требованиям специалистов по радиационной физике; однако для целей данной книги это, вероятно, вполне приемлемо.

Результаты и основные положения классической радиационной генетики [1528, 1656, 97]. Наиболее важные результаты и положения классической радиационной гене-

5. Мутации 225

тики можно суммировать следующим образом.

1. Для индукции мутаций в определенной клетке необходимо, чтобы эта клетка (например, половая) подверглась прямому воздействию радиации. Данное утверждение не является таким уж совершенно самоочевидным, как это может показаться. Нельзя исключить a priori и возможные опосредованные влияния, например в результате индукции соответствующего химического вещества, доставляемого к гонадам током кровообращения; в работах последнего времени действительно было выявлено несколько случаев такого непрямого воздействия. Однако для всех практических целей данное положение тем не менее служит хорошим приближением к реальной ситуации. Этот принцип имеет большое значение при изучении последствий облучения человеческих индивидов, так как высокий уровень поглощения некоторых видов радиации (УФ-излучения или рентгеновских лучей очень низкой энергии) предотвращает их опасное воздействие на половые клетки. Тем не менее они могут представлять известную опасность, приводя к возникновению соматических мутаций и вызывая рак.

2. Радиация не порождает каких-либо новых биологических феноменов; она лишь увеличивает вероятность возникновения различных мутаций и клеточных событий, которые время от времени происходят спонтанно. Мутации, индуцированные радиацией, по существу не отличаются от спонтанных мутаций. Этот принцип нашел подтверждение и в случае мутаций, индуцированных химическими веществами. Однако не все типы спонтанных мутаций увеличиваются в числе под воздействием всех мутагенных факторов в одинаковой степени. Наоборот, существуют определенные различия в относительных частотах как разных типов спонтанных мутаций, так и мутаций, индуцированных радиацией и химическими веществами. Тот факт, что индуцируемые мутации любого типа могут также возникать спонтанно, создает трудную статистическую проблему при попытках доказать, что увеличение частоты мутаций в популяции человека обусловлено воздействием мутагенных факторов. Это можно пояснить на примере из области тератологии человека: талидомид, применяемый в качестве снотворного, при неоднократном употреблении или даже при однократном приеме во время ранней беременности оказывал тератогенное действие. Комбинация уродств, вызванных этим лекарством, отличается чрезвычайным своеобразием; сочетание коротких деформированных конечностей (фокомелия) с пороками развития ушей, глаз и внутренних органов прежде почти никогда не наблюдалось. Именно это своеобразие в первую очередь и навело врачей на мысль о несомненной новизне данного феномена и побудило их заняться поиском возможного тератогенного фактора. Однако, если бы это лекарство вызывало появление новорожденных с расщепленной губой и небом или с дефектами нервной трубки, а не с фокомелией, то весьма вероятно, что оно по-прежнему считалось бы вполне пригодным снотворным с превосходными показаниями для применения во время беременности. Из сказанного следует, что любой мутагенный фактор, неумышленно введенный в нашу окружающую среду и вызывающий такие же по величине повреждения, как талидомид, наверняка остался бы невыявленным.

3. Третья, часто обсуждаемая проблемаэто проблема зависимости частоты мутаций от дозы. В случае мутаций, для возникновения которых необходимо только одно первичное событие, было показано, что график зависимости доза-эффект представляет собой просто прямую линию:

М = μ + kD

(М - число мутаций; μ - частота спонтанных мутаций; D-доза, k -частота мутаций/единица дозы). Такая линейная зависимость эффекта от дозы радиации имеет место только тогда, когда индуци-

226 5 Мутации

Рис. 5.25. Линейное увеличение частоты мутаций в случае точковых мутаций и хромосомных разрывов у Drosophila melanogaster Обратите внимание на линейность зависимости эффекта от дозы [1656]

рованные мутации содержатся в небольшой части всех облученных клеток При более высоких мутационных частотах проявляется определенный «эффект насыщения», приводящий к выходу графика на плато. В этом случае данная функция более адекватно описывается экспоненциальным уравнением. Пример рассматриваемой зависимости, в котором использованы данные, полученные на Drosophila melanogaster, приведен на рис. 5.42. Здесь применялись довольно большие дозы облучения; исследования при более низких дозах подтверждают существование линейной зависимости. Для интервала доз, включающего эти относительно низкие величины, подобные материалы выглядят не слишком убедительно, поскольку для совмещения графика зависимости доза-эффект с реальными данными требуются очень большие выборки

Эти результаты интерпретировались на основе теории мишени. Каждое мутационное событие происходит в результате однократного попадания в определенную восприимчивую структуру, и вероятность поражения этой структуры растет линейно с увеличением дозы. Эффект насыщения при очень высоких дозах (более высоких, чем те, что были использованы в экспериментах, результаты которых отражены на рис. 5.42) обусловлен тем, что в данном случае одна и та же структура поражается более одного раза

4. Эта теория предсказала нелинейную зависимость эффекта от дозы радиации в случае мутаций, для возникновения которых необходимо осуществление более одного первичного события Для появления многих транслокаций требуется возникновение двух разрывов в течение довольно короткого временного интервала и воссоединение разорванных хромосом примерно за такое же время Однако эти два разрыва не обязательно должны осуществляться в результате двух отдельных попаданий Они могут быть индуцированы одной частицей или фотоном, особенно при очень высокой плотности ионизации, например при использовании нейтронов. В этом случае ожидается зависимость доза-эффект, состоящая из линейной (одноударной) и квадратической (двуударной) компонент

М = μ + k₁D + k₂D².

Такие зависимости эффекта от дозы действительно были обнаружены во многих экспериментах. На рис 5.43 приведена в качестве примера соответствующая кривая, построенная по данным, полученным на Drosophila melanogaster

5. В случае одноударных событий эта теория позволяет сделать еще одно предсказание, имеющее громадное практическое значение Число попаданий, очевидно, зависит от дозы радиации, а не от времени, в течение которого она воздействует. Следовательно, здесь не имеет значения, дается ли одна и та же доза за очень короткое время (большая «мощность дозы») или распределяется по гораздо более длительному временному интервалу (малая «мощность дозы»). Первые эксперименты на Drosophila казалось подтверждали это предсказание (рис. 5.44). Однако последующие результаты, полученные на мышах [1611], вызвали серьезные сомнения в правильности сделанных из них выводов. В настоящее время общепринятым

5. Мутации 227

	Рис. 5.43. Возникновение хромосомных аберраций (события с двумя разрывами) в зависимости от дозы радиации (в 10 Гр). Двуударная кривая (сплошная пиния) лучше соответствует существующим данным, чем одноударная зависимость (пунктирная линия). Данные получены разными авторами. На рисунке нанесены экспериментальные точки и их стандартные отклонения [1656].
	Рис. 5.44. Облучение Drosophila melanogaster дозами радиации в 35 Гр при разных мощностях дозы. Различия по частоте мутаций, по-видимому, отсутствуют (горизонтальная линия). См., однако, текст [1656].

считается представление о том, что определенная доза, примененная при относительно низкой мощности, приведет к меньшему числу мутаций, чем та же доза при более высокой мощности.

Подтверждение и дополнение этих результатов. Громадное число исследований с использованием других материалов помогло подтвердить и дополнить эти выводы. При этом учитывалась стадия развития облученной половой клетки; используя различные (например, биохимические) фенотипы, исследователи выявили химические реакции, которые обусловливают возникновение мутаций, индуцированных радиацией.

Влияние химической среды и содержания О₂ в облученной ткани. Одним из вторичных последствий облучения является образование высокоактивных радикалов, например пероксидов. Для их образования необходим кислород. Поэтому неудивительно, что высокое содержание кислорода в облученной ткани усиливает индукцию мутаций. Этот эффект сильно выражен, например при облучении рентгеновскими лучами. Он почти или полностью отсутствует в случае плотно ионизирующей радиации, например при облучении α-частицами.

Молекулярные эффекты радиации [1660]. В классической радиационной генетике мутагенные эффекты выявлялись на фенотипическом уровне. Однако уже на ранней стадии ее развития были предприняты морфо-

228 5. Мутации

логические исследования хромосом, особенно у растений вроде традесканции, и было показано, что многие мутационные изменения можно объяснить индукцией морфологически различимых хромосомных разрывов и их последствиями, например транслокациями.

В течение длительного времени не было известно, может ли ионизирующая радиация индуцировать мутации. Многие исследователи считали это вполне вероятным, однако нельзя было исключить возможность, что все мутации, индуцированные радиацией, являются небольшими делециями или хромосомными перестройками. Недавно этот вопрос был решен с использованием фага фХ174, имеющего только одну цепь ДНК. В этих экспериментах регистрировали реверсии, возникновение которых нельзя объяснить каким-либо иным механизмом, кроме единичной точковой мутации. У бактерий индукция генных мутаций, в том числе транзиций, обнаружена в триптофановом локусе E.coli [1660].

Первой эукариотической системой, в которой наблюдались генные мутации, индуцированные радиацией, была Neurospora crassa [1544; 1618]. 42% выявленных мутаций оказались транзициями, 37% – вставками или делениями отдельных пар оснований, а остальные имели различное происхождение, причем часть из них, вероятно, были трансверсиями.

Основные положения радиационной генетики нашли подтверждение в исследованиях на хромосомах лимфоцитов человека [1395; 1387]. Большинство работ по классической радиационной генетике выполнено на организмах, находящихся лишь в отдаленном родстве с человеком, например на Drosophila. Эксперименты по облучению хромосом проводили главным образом на растениях. Исследования на человеке начались вскоре после разработки метода получения хромосомных препаратов из лимфоцитов (разд. 2.1.2.2). Методические детали и классификация структурных хромосомных аберраций обсуждаются в разд. 2.2.2. Особенно хорошим индикатором хромосомных разрывов оказались дицентрические хромосомы. На рис. 5.45 изображена соответствующая зависимость эффекта от дозы облучения. Она носит более или менее линейный характер, но при сравнительно высоких дозах проявляет тенденцию к увеличению крутизны. Такие зависимости доза-эффект имеют место в том случае, если одни первичные события являются одноударными, а другие - двуударными. Для образования дицентрика необходимы два разрыва в хромосомах, находящихся в близком соседстве. Если наши теоретические посылки правильны, эти разрывы

Рис. 5.45. Кривые зависимости эффекта от дозы для дицентрических и кольцевых хромосом после облучения лимфоцитов человека in vitro. Δ - острое и О - хроническое облучение. Для каждой точки указаны стандартные ошибки [1400].	Рис. 5.46. Кривые зависимости эффекта от дозы при остром облучении in vitro лимфоцитов человека, культивируемых in vitro, для дицентриков, кольцевых хромосом, фрагментов, содержащих центромеру и ацентрических фрагментов [1395].

5 Мутации 229

Рис. 5.47. Доля метафаз с дицентрическими хромосомами ( ) и кольцевыми хромосомами ( ) после облучения in vitro 2 Гр рентгеновских лучей. Уменьшение эффекта с увеличением времени экспозиции и понижением мощности дозы (= увеличением времени экспозиции) [1400].

могут быть вызваны как одним, так и двумя попаданиями. Следовательно, найденная зависимость эффекта от дозы не противоречит этим соображениям. На рис. 5.46 приведены также данные, касающиеся образования кольцевых хромосом и фрагментов.

На рис. 5.47 показано уменьшение числа дицентрических и кольцевых хромосом при понижении мощности дозы. Эти данные подтверждают существование эффекта мощности дозы, обнаруженного на других организмах, в частности на мышах. Приведенные результаты убедительно свидетельствуют о том, что основные феномены радиационной генетики могут в принципе быть продемонстрированы и на хромосомах человека.

Человеческая популяция подвергается воздействию ионизирующей радиации, излучаемой множеством источников. Общество ждет от генетиков информации о масштабах возможной опасности. Как мы ответим на эти волнующие людей вопросы?