2.4.2. Будова рестрикційних карт

Ферменти рестрикції стали ефективним інструментом досліджень. Вони дозволяють перетворювати молекули ДНК великих розмірів у набір фрагментів (рестриктів) довжиною від декількох сотень до декількох тисяч основ. За допомогою методу електрофорезу в агарозному гелі фрагменти ДНК, що розрізняються за розмірами, можна розділити, а потім досліджувати кожен рестрикт окремо. Розподіл молекул ДНК засновано на тому, що фрагменти різної довжини рухаються із різною швидкістю. У розчинах ДНК існує у вигляді аніону і за накладання електричного поля, починає рухатися до позитивно зарядженого кінця.

Однак, у розчині здійснити процедуру відокремлення фрагментів ДНК неможливо, тому як носія використовують гель-концентрований розчин полімеру.

Короткі рестриктази мігрують значно швидше, ніж довгі. За відносно високою концентрацією агарози великі фрагменти зовсім не здатні проникати у гель. Під час міграції рестрикційні фрагменти не деградують, їх можна елюювати (вимивати) у вигляді біологічно активних дволанцюгових молекул. За введенні гелі барвників, що здатні зв'язуватися із ДНК, створюється набір смуг, кожна з яких відповідає певному рестрикту, молекулярну масу якого можна визначити за допомогою каліброваної кривої, що була попередньо побудована за використання ДНК з відомими молекулярними масами (рис. 13, 14).

Рис. 13. Результати гель-електрофорезу фрагментів ДНК, що отримані за розщеплення рестриктазами:1.−ДНК фага ; рестриктаза - HindIII;2.−ДНК фага 174; рестриктаза - НаеIII;3.−ДНК плазміди pBR322; рестриктаза - BstNI

Рис. 14. Схематичне зображення фрагментів ДНК фага X, отриманих під дією різних рестриктаз(на шкалі вказані розміри фрагментів)

Використання електрофорезу для розподілу рестрикційних фрагментів дає можливість отримувати рестрикційні карти. Перша карта була отримана для вірусу SW40 (вірус мавпи, що викликає злоякісну трансформацію), який містив 5423 пари основ. Використовували рестриктазу HindII, що розщеплює кільцеву ДНК вірусу на 11 фрагментів. Проведення аналогічних досліджень за використання іншої рестриктази і зіставлення отриманих результатів дозволили створити рестрикційну карту, в якій вказані порядок розташування сайтів рестрикції.

Обробка зразка ДНК певною рестриктазою IIкласу завжди дає один той самий набір фрагментів − за умовою, що розщеплення відбувається по всіх сайтах розпізнавання. Якщо використовувати декілька ферментів рестрикції і спочатку обробляти ДНК кожної з рестриктаз окремо, а потім їх комбінаціями, можна побудувати фізичну карту даної ДНК. Тобто встановити порядок розташування сайтів рестрикції вздовж молекули. Визначивши розмір отриманих фрагментів за допомогою гель-електорофезу, можна знайти положення сайтів рестрикції (здійснити картирування).

Для побудови рестрикційних карт, необхідно порівняти розміри фрагментів, що отримані за розподільною рестрикцією, тобто рестрикції, що відбулися під впливом кожної з рестриктаз окремо, і за рестрикції сумішшю ферментів. На рисунку 15, а вказано розміри фрагментів, що отримані внаслідок розщеплення ДНК даними рестриктазами та їх сумішшю. З отриманих даних бучимо, що вказана ділянка ДНК має по два сайти для EcoRlі ВатНІ.