4. Моноклональні антитіла
Здійснити злиття клітин ссавців методично простіше, так як вони не мають клітинних стінок. Перший метод контрольованого злиття клітин ссавців був заснований на використанні інактивованого вірусу Сендай. Його віріон покритий ліпідвмісною оболонкою, яка зливається з мембранами двох клітин і сприяє їх злиттю. Використовується також Са2+, ПЕГ, лізолецитин. Уже в 60-ті роки розроблено методи злиття соматичних клітин тварин і людини.
Один з результатів методу злиття клітин ссавців швидко знайшов застосування в біотехнології. Це лінії клітин, одержані при гібридизації за участю клітин мієломи з допомогою яких можуть вироблятись моноклональні антитіла, тобто антитіла здатні реагувати лише з одним антигеном. Такі клітини називають — гібридоми («Безсмертні» клітини одержуються злиттям ракових клітин з клітинами що продукують цінні речовини).
Більшість антигенів викликає в організмі утворення набору суміші антитіл. Але кожен лімфоцит продукує лиш одне антитіло. Та лімфоцити не можуть рости в культурі.
Мієломи — злоякісні утворення імунної системи, які мають здатність до необмеженого росту і продукують (синтезують) один тип білків — антитіл. Тобто це природний продуцент моноклональних антитіл.
Метод їх одержання розроблений в Кембріджі Мільштейном і Келлером. Проводять злиття нормальних лімфоцитів і клітин мієлом. Спочатку гібридоми синтезують 2 типи антитіл батьківських клітин. Надалі внаслідок елімінації хромосом утворюються клітини здатні синтезувати антитіла одного типу. Скрінінг і виділення клону синтезуючого необхідне антитіло ведуть за допомогою біохімічних і імунологічних методів.
Цим методом з використанням ПЕГ одержували антитіла для великої кількості антигенів.
Одержання гібридом на основі мієломних клітин і імунізованих лімфоцитів складається із наступних етапів:
одержання мієломних клітин, які гинуть при подальшій гібридизації;
одержання лімфоцитів — продуцентів антитіл до заданих антигенів;
злиття мієломних клітин з лімфоцитами (агентом являється ПЕГ, вірус Сендай і лізолецитин, а також електричний імпульс);
скринінг гібридомних клітин;
перевірка здатності продукувати задані моноклональні антитіла;
клонування гібридних клітин з контролем на стабільність імунних властивостей;
одержання масових культур гібридомних клітин на поживних середовищах, або в організмі тварин у вигляді асцит них пухлин.
Гібридоми можна зберігати в замороженому стані (гібридомні банки в інститутах і лабораторіях).
Мілетейн та його працівник Келер лабораторії молекулярної біології Медичної науково - дослідної ради Кембріджу (Великобританія) першими запропонували спосіб отримання гібридом. Тобто, їм вдалось отримати клон клітин, які б секретували антитіла до відомого антигену. Келер запропонував злити мієломну клітину з лімфоцитами із популяції, яка б мала попередній контакт з певним антигеном. За його розрахунками, отримана таким чином клітина, повинна синтезувати антитіла відповідної специфічності і одночасно володіти здатністю до необмеженого росту подібно злоякісній мієломній батьківській клітині. Успіх цього заходу уявлявся малоуспішним, оскільки: 1) лімфоцити важко піддаються злиттю; 2) для виявлення клітин із заданими властивостями треба було б дослідити тисячі гібридних клітин.
Проте в 1974 р. Келеру вдалось отримати злиття клітин мієломи та лімфоцитів селезінки миші, яка була імунізована еритроцитами барана у присутності поліетиленгліколю. Таким чином, будучи отриманими шляхом злиття антитілоутворюючих та злоякісних клітин, ці клітини - химери, названі гібридомами, успадкували здатність до необмеженого росту в культурі і в той же час продукувати антитіла певної специфічності (моноклональні антитіла).
Застосування моноклональних антитіл.
Гібридома - це один із варіантів використання культури клітин в цілях б/т. З допомогою гібридомної біотехнології стає можливою регуляція імунної відповіді за рахунок отримання моноклональних антитіл заданої специфічності. В нашій країні також отримані конкретні практичні результати. В Інституті мол. біології АН СРСР, Ін - ті фізіології АМН СРСР отримані моноклональні антитіла до одного з найбільш широко розповсюджених штамів вірусу грипу. Гібридоми можна зберігати у замороженому стані, в деяких інститутах та лабораторіях для наукових цілей створені гібридомні банки. Ще на початку 80 - х рр. XX cт. вартість 1 г моноклональних антитіл коштувала 200 - 400 $.
1. Фармацевтичні фірми були зацікавлені у виробництві моноклональних антитіл, оскільки сфера їх використання включала різноманітну діагностику (ідентифікація певного гормону, вірусних або бактеріальних антигенів, антигенів групи крові та тканниних антигенів).
2. Завдяки використанню моноклональних антитіл (монАТ), отриманих в результаті імунізації тварин ліками, вдалось можливим визначення дози цих ліків.
3. У Англії вдалось отримати антитіла, які специфічно "впізнають" злоякісні пухлини товстої та прямої кишки. Відкриття цих вчених (1982 р.) було застосоване в наступних роботах для діагностики деяких форм раку щитовидної залози, епітеліальної форми раку.
Крім цього, починаючи з 1979 р. в декількох американських лабораторіях створили моноАТ, які специфічно реагують з антигенами раку легень, молочної залози, а також з антигенами мієлом, лімфом та лейкозів. Слід відзначити, що концентрація антигенів, які були виявлені у сироватці хворих раком підшлункової залози корелювала із стадіями захворювання. Рак підшлункової залози як правило діагностується надто пізно, коли його вже неможливо лікувати, ось чому так важливо використовувати моноАТ для ранньої діагностики, які специфічно вловлюють антигени у сироватці крові хворих.
Харіс та співробітники (Оксфордський університет) ідентифікували та виділили в достатній кількості cal - антитіла, які розпізнають так званий Cal -антиген, який представлений на клітинних мембранах великої кількості злоякісних пухлин людини (рак молочної залози, матки, нирок, горла, легень, шлунку, тонкої кишки та печінки, пухлин сполучної тканини та тканини кісток). Цей антиген відсутній на поверхні клітин доброякісних пухлин тих же органів та тканин (бородавки, кісти, аденоми), так і в нормальних клітинах. Можливість виявлення молекули Cal, цього маркеру злоякісного переродження тканини, з допомогою простого та високоспецифічного імунологічного тесту послужило основою для створення методу точної діагностики на зрізах тканин та інших об'єктах. Корпорація "Welcome phaundation" збирається випустити у продаж Cal - антитіла, найбільш цінною властивістю яких є точність та швидкість діагностики раку. На думку багатьох спеціалістів, молекулярна онкологія ознаменувала собою нову еру у вивченні канцерогенезу. Злоякісну пухлину вдається виявити, коли вона складається приблизно із млрд. клітин, іншими словами, коли на кожну ракову клітину в організмі припадає 100000 здорових клітин. В ідеалі лікування раку заключається у винищенні злоякісних клітин без пошкодження здорових, ось тому досить цінною характеристикою протипухлинного препарату є його вибірковість дії. Проте протиракові засоби як правило діють на клітини, які швидко діляться, а це робить їх малоефективними по відношенню до пухлин, які розвиваються повільно. Ще один спосіб використання моноАТ у терапії - поєднання їх з цитотоксичними речовинами.
Найбільш ефективні речовини проти ракових клітин - це отрути рослинного та бактеріального походження (дифтерійний токсин, рицин - токсин з насіння рицини, a - аманітин - компонент яду блідої поганки). І вже починаючи з 1978 р. групами деяких вчених створені гібридні молекули або імунотоксини. В експериментах на тваринах імунотоксини здатні затримувати ріст та розвиток пухлин. Проте слід відмітити, що одна із багаточисельних причин, які стимулюють використання даних препаратів в терапії раку та загальній терапії - це відсутність моноАТ людського походження. Всі експерименти проводились з моноАТ мишей або поліклональними АТ від груп різних тварин.
4. З допомогою моноАТ можливе виділення біологічно активних речовин (білків, гормонів, токсинів) із складних сумішей.
5. МоноАТ здатні також нейтралізувати дію лімфоцитів, що відповідають за відторгнення трансплантанту, а також аутоантитіл, які утворюються при аутоімунних захворюваннях (деякі форми діабету, розсіяний склероз, ревматичні хвороби). В поєднання з лікарськими препаратами вони можуть значно посилювати ефективність дії останніх на клітини-мішені, дозволяючи при цьому уникати серйозних побічних явищ, які як правило супроводжують хіміотерапію раку.
6. Для діагностики та лікування захворювань, які викликаються патогенами, перш за все м/о та їх токсинами.
7. З допомогою біосенсорів, сконструйованих на основі мАТ, діагностують вагітність, виявляють схильність до діабету, ревматоїдного артриту, спадкових захворювань.