Культивування і застосування тваринних культур тканин.
Рослинні клітини мають необмежену здатність до поділу.
Одна з основних властивостей клітинних культур еукаріот є обмежений (навіть за умови переносу їх на свіже поживне середовище) час життєдіяльності Після 50 — 100 поділів клітинні культури гинуть. Навіть фібробласти, які добре переносять культивування витримують 50 поділів, якщо донор — плід, 30 — новонароджений. Смерть клітин — результат реалізації генетичної програми.
Анеуплоїдні клітини (у яких число хромосом в ядрах не є кратним гаплоїдному набору, а також багато ліній пухлинних клітин культивуються добре. Тому їх використовують у наукових дослідженнях і біотехнології.
З 1951 p. культивується лінія клітин Неlа - пухлин негритянки з раком матки (ріст пухлинних клітин негрів інтенсивніший).
Для підтримання функціонально-активного стану в культурі перш за все здійснюється розробка відповідних умов культивування і стандартизація складу поживного середовища. У 1955 p. Г. Ігл запропонував багатокомпонентну суміш відому як середовище Ігла. Потім були запропоновані модифікації іншими авторами. Якщо до складу середовища „вимоги клітин” не дуже суворі, то допустимі коливання рН середовища незначні (7,2 — 7,4), збільшення або зменшення рН на 0,2 — 0,4 призводить до гибелі клітин. Перевага надається таким буферам як гліцилгліциновий, трис(гідроксиметил)-амінометановому і 4(2-гідроксиетил)-1-піперазинсульфо-кислотному (ГЕПЕС) буферам.
Клітинну масу одержують шляхом ферментативної обробки (трипсином) відповідного органу. Він розпадається на окремі клітини, які переносяться на стерильне поживне середовище. Поодинокі еукаріотичні клітини не здатні до поділу. Тому застосовується так званий шар живлячих клітин (клітини, які втратили після опромінення здатність ділитись але зберігають метаболізм). Призначені для клонування клітини наносить на вищезгадані і цього досить щоб вони почали ділитись (< 100%).
При добавлянні в поживне середовище мітогенів (сироватка крові) здатність клітин ділитися зростає. Серед них такі фактори росту (ФР), які володіють властивістю гормонів. Ідентифіковані ФРН (фактор росту нервів), ФРЕ (епідермісу), ФРФ (фібробластів), це білки які стимулюють мітоз, але спектр їх дії набагато ширший. Вплив сироватки крові тим ефективніший чим молодша тварина –джерело тканин бажане з ембріонів.
Крім факторів росту мітогенною дією володіють лектини. Джерело лектинів — бобові: (1,5 — 3% всіх їх білків, наприклад фітогемаглютенін - ФГГ), бактерії, равлики, електричний угорь, рицин з насіння рицини, конканвалін — з конвалії та ін.
Нормальні клітини утворюють у культурі 1 шар, пухлинні — багатошарове утворення.
Злиття клітин відбувається не лише в організмах а і в культурах клітин. Утворюються полікаріони; гомокаріони, гетерокаріони. Злиття в гетерокаріонах ядер після злиття клітин приводить до виникнення клітинного гібриду.
Основні методи злиття клітин.
1. Використання інактивного вірусу Сендай, який відноситься до групи вірусів парагрипу, який інактивований УФ - випромінюванням. Цей метод вже майже не використовується (лише в тих випадках, коли клітини іншими методами не зливаються - при роботі з ядерними еритроцитами птахів).
2. Основний метод - використання поліетиленгліколю (ПЕГ). Це стандартний спосіб, який використовується при злитті клітин тварин та рослин, між собою та один з одним, а також при отриманні гібридом.
3. Злиття клітин з використанням лазерного та нейтронного опромінення.
4. Електрозлиття - клітини попередньо зближені між собою, піддають впливу електричного поля; спочатку проходить об'єднання мембран, потім цитоплазми і нарешті гібридної клітини.
Нові методи злиття.
1. Авідин - біотиновий метод. Клітини одного типу (мієлома) з'єднують з авідином, клітини іншого типу (імунні лімфоцити) безпосередньо або через антитіла з'єднують з біотином (віт. Н). Такі мічені клітини в суспензії з'єднуються попарно і в результаті дії електричного поля (в яке їх поміщають) і т.ч. утворюються гібридомні клітини.
2. Метод проточної цитометрії. Цей метод застосовують:
-- наприклад, для виділення клітин, що знаходяться на певній стадії клітинного циклу та їх синхронізації. Отримані таким шляхом клони життєздатні і дають початок клітинним клонам;
-- для відбору (селекції гібридних клітин). Не всі клітини, що піддаються різним впливам для злиття, зливаються. Для видалення клітин, що не злилися, суміш гібридних і клітин, що не злилися, вирощують на від ірковому середовищі, де виживають лише гібридні клітини.
Гібридизація широко використовується в генетиці, біології клітини, вірусології, біології пухлин та ін. галузях біології. За допомогою методу гібридизації соматичних клітин вдається реактивувати онкогенний вірус, виявити його в пухлинах. Введення їх суспензії тваринам дає інформацію про механізм виникнення раку. Цей метод застосовується для вивчення клітинних гібридів в культурі. По продуктах експресії хромосоми, яка залишається в геномі синкаріону з батьківської клітини, визначаються ознаки генетичних спадкових захворювань людини.