Клітинна інженерія

ПЛАН

1. Методи й умови вирощування ізольованих клітин і тканин рослин.

2. Соматична гібридизація рослин та її перспективи.

3. Культивування і застосування тваринних культур тканин.

4. Моноклональні антитіла. Трансплантація ядер.

5. Клонування.

1. Методи й умови вирощування ізольованих клітин і тканин рослин

Застосування ізольованої культури тканин, а також тотипотентності рослинних клітин розкрило великі можливості у вирішенні глобальних теоретичних і практичних завдань. У галузі фундаментальних наук стало можливим дослідження таких складних проблем як взаємодія клітин у тканинах, клітинне диференціювання, морфогенез, реалізація тотипотентності клітин, механізми появи ракових клітин.

При вирішенні практичних завдань основну увагу приділяють питанням селекції, одержанню значної кількості біологічно-цінних метаболітів рослинного походження (ліків), а також вирощування оздоровлених безвірусних рослин.

Поживне середовище для культур тканин, клітин.

Для підтримання функціонального стану клітин в культурі було суттєво розроблено методи умов культивування та їх відтворення. Перш за все було стандартизовано склад поживної суміші. Для клітин ссавців була розроблена багатокомпонентна суміш, яка відома як середовище (Ігла) Леля (рН = 7,2 - 7,4). Для культури рослин - базове середовище Мурасіге та Скуга.

Одна з необхідних умов - жорстке контролювання умови стерильності (використання одноразового стерильного пластмасового посуду та ін.). Правил асептики дотримуються в асептичних кімнатах або ламінарному боксі. Це потік стерильного повітря з боксу на працівника, УФ лампи і стерильний одяг, стерилізація спиртом інструментів, столів, сушильна шафа (150⁰С), автоклавування (120⁰С) поживних середовищ, або пропускання їхніх компонентів через бактеріальні фільтри. Рослинні тканини стерилізуються у дезинфікуючих розчинах (Н₂О₂ 10-12%, сулема 0,1%, діацид 0,1%) або антибіотиках, промивають дистильованою водою, зрізають верхній шар клітин скальпелем.

До складу всіх поживних середовищ входять вуглеводи, вітаміни, мікро- і макроелементи (NO₃, Р, К), фітогормони і їх синтетичні аналоги. Обов’язковий розчин 2-3% сахарози або глюкози, так як у більшості калюсної тканини (крім амаранта, мандагори та ін.) відсутній хролофіл, тому вирощують її у темноті або розсіяному світлі. Ауксини визивають дедиференціювання клітин експлантата, цитокініни – індукують поділ.

Виснаження поживного середовища значно знижує ріст і процеси метаболізму, але встановлено, що низький вміст фосфатів стимулює синтез вторинних метаболітів (фенольних сполук). У середовище можуть добавляти ендосперм зародків кінського каштана, кокосового горіха та ін.

Саме універсальне для рослинних культур середовище Мурасіге і Скуга. (табл.)

Світло може активізувати процеси і забезпечувати морфогенез. Використовують люмінесцентні лампи. У кожному окремому випадку підбирають оптимальну інтенсивність освітлення і режим (безперервний, УФ, певної довжини хвиль). Для більшості культур оптимальна температура 26⁰С, але для утворення метаболітів у деяких випадках необхідне зниження до 18-20⁰С. Дуже важлива аерація, вологість у боксах 60-70%.