16. Общий способ получения рекомбинантного белка.Инсулин.Источники получения......

Общий метод получения рекомбинантного белка.

Проводится молекулярное клонирование гена или фрагмента; проводят трансформацию клеток и отбор клонов. Затем культуру выращивают. Проводят выделение и очистку.

Инсулин-пептидный гормон,регулирующий углеводный обмен. Состоит из двух полипептидных цепей-А (21 аминокислотный остаток) и В (30 аминокислот), связанных дисульфидными связями между остатками цистеина. А цепь имеет дополнительную внутреннюю дисульфидную связь. Дисульфидные связи обеспечивают пространственную структуру молекулы.

Последовательность цепей была установлена в 1955 году Сенгером. Синтез обеих цепей был осуществлен в 1963 году и включал 170 химических реакций. Получали инсулин до 1980г за счет выделения его из поджелудочной железы свиней и КРС (для получения 1г кристаллического инсулина требовалось 30000-35000 голов). В 1980г разработали метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем ферментативного замещения остатка аланина,который является 30 ой аминокислотой в цепи В на остаток треонина. В результате получили однокомпонентный инсулин человека 99% чистоты. В организме животного две полипептидные цепи являются частями белковой молекулы длиной 109 аминокислот-это препроинсулин. При синтезе в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для транспорта молекулы через мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются и образуется проинсулин,длиной 86 аминокислотных остатков.

В 1980г Гимберт выделил Мрнк инсулина из опухоли бета клеток поджелудочной железы крысы.

Постороение принципиальной схемы рекомбинантной ДНК,используемой для получения проинсулина человека.

1 способ: биосинтез инсулиа через синтез биологического предшественника-проинсулина.

Рекомбинантная плазмида содержит последовательность нуклеотидов,кодирующую А и В цепи инсулина и кодирующую С пептид, сигнальный участок и промотор. Сигнальный (лидерный) участок нужен для придания свойств целевому продукту. Участок промотора запускает синтез рекомбинантного белка.

2 способ: раздельный биосинтез А и В цепей. Проводится две различные ферментации химерных штаммов, проводится два процесса выделения. Завершающая стадия-объединение цепей.

Современный способ получения отечественного инсулина.

Используется штамм-продуцент E.coli . Конструкция плазмиды обеспечивает синтез рекомбинантного белка,представляющего собой лидерную (сигнальную) последовательность и фрагмент белка А (специфический белок золотистого стафилококка), а также последовательность проинсулина человека. Между этими последовательностями находится метионин,который разрушают галогенцианами. Плазмида содержит ген устойчивости к бета лактамным антибиотикам, и поэтому при культивировании биомассы в питательную среду добавляют антибиотики. Они подавляют рост патогенных микроорганизмов и клеток E.coli, потерявших плазмиду. После наращивания основного количества биомассы в среду вносят специальный индуктор. Его вносят для ускорения процесса биосинтеза. В результате этого в достаточном количестве синтезируется рекомбинантный белок. Ферментация E.coli занимает 12 часов. Далее культуральную жидкость разделяют на проточной центрифуги,после чего клетки дезинтегрируют. Затем гомогенат очищают от балластных водорастворимых белков при помощи буферных растворов. Получается осадок рекомбинантного белка,который нужно растворять в концентрированных растворах мочевины. Далее проводят осветление на сепараторе и дополнительно очищают от механических примесей путем микрофильтрации. Полученный раствор подвергают ионообменной хроматографии для удаления примесей. Очищенный гибридный белок будет в форме солевого раствора,который обессоливают путем гель-фильтрации или методом молекулярных сит.После обессоливания гибридный белок концентрируют методом мембранного ультрафильтрования. Далее сушат в вакууме на лиофильной сушилке.

Химическая и ферментативная трансформация рекомбинантного белка.

1 стадия: Для отделения проинсулиновой части от лидерной последовательности необходимо провести химический гидролиз. Его проводят бромцианом в концентрированной муравьиной кислоте. Приэтом,гибридный белок расщепляется по остатку метионина. Смесь разделяется хроматографическими методами. В выделенном проинсулине дисульфидные связи расположены хаотически. Пространственная конфигурация определяется первичной последовательностью.

2 стадия прцесса-разрушение дисульфидных связей

3 стадия процесса-правильное замыкание. Молекула проинсулина сворачивается таким образом,что начальный и конечный сегмент сближения. При помощи С пептида происходит правильное расположение цепи А и В. Проинсулин является предшественником физиологического инсулина и отличается от него наличием С пептида, который содержит 35 аминокислот.

4 стадия процесса-ферментативный гидролиз

Гидролизуют проинсулин смесью трипсина и карбоксипептидазы. После хроматографической очистки и обессоливания получают раствор из которого необходимо выделить белок или лиофильным высушиванием,или высаливанием солями цинка.

17. Интерфероны. Классификация. Видоспецифичность интерферонов. Ограниченные возможности получения альфа и гамма интерферонов из лейкоцитов и Т лимфоцитов. Лимфобластоидный интерферон. Методы получения бета интерферона при культивировании фибробластов. Индукторы интерферонов. Их природа. Механизм индукции. Промышленное производство интерферонов на основе природных источников. Синтез различных классов интерферона человека в генетически сконструированных клетках микроорганизмов. Проблема стандартизации. Производство рекомбинантных образцов интерферона и политика различных фирм на международном рынке.

Интерфероны: Рекомбинантный альфа интерферон -Роферон А -Интрон А –Реальдирон Рекомбинантный интерферон альфа 2 в: -Офтальмоферон -Герпферон -Инфагель –Альтевир Рекомбинантный бета интерферон: -Авонекс –Бетаферон Рекомбинантный гамма интерферон :-Имукин -Ингарон

Интерферон был открыт в 1957 году Айзексом и Линдеманом в культуре клеток цыпленка, зараженной вирусом гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируемое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. Лейкоциты при заражении вирусами продуцируют несколько интерферонов,объединяемых в семействе интерферонов, ингибирующих продуктивный цикл репликации вирусов. В обычных неиндуцирующих клетках интерферон не вырабатывается. Интерферон разделяют на три группы: альфа,бета,гамма-лейкоцитарный,фибробластный,иммунный. Интерфероны бета и гамма являются гликопротеинами, альфа-протеином. Интерфероны это клеточные белки и поэтому они видоспецифичны,однако они не вирусоспецифичны. При смешанной вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интерфероногенности первого, этот финвальный называют вирусной итерференцией. Человеческие интерфероны альфа и бета продуцируются преимущественно лейкоцитами, лимфобластами и фибробластами. Интерферон гамма прежде называли иммунным или интерфероном 2го типа, он образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Т лимфобластами при стимуляции специальными антигенами.

Индукторы интерферонов:

Инактивированные температурой или УФ излучением вирусы гриппа,ротовирусы

Двунитевые РНК

Некоторые полианионные вещества

Синтетические двунитевые полирибонуклеотиды

Интерферон альфа выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную среду,содержащую либо сыворотку крови человека или козеин молока. В среду вносят вирус интерфероноген, его инкубируют,после чео лейкоциты отделяют центрифугированием. Вирус интерфероноген инактивирует надосадочную жидкость,представляет собой нативной интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Препарат представляет собой пористый серовато-коричневый порошок,легко растворимый в воде. Растительный препарат имеет розово-красный цвет и слегка опалесцирует. Из нативного можно получить концентрированный путем очистки на сефадексе или мембранной фильтрацией. Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовао-белого цвета,хорошо растворим в воде.

Интерферон бета получают из фибробластов,выращенных в монослойной культуре в присутствии циклогексимида и актиомицета Д.

Получение генно-инженерных интерферонов.

Исследователи использовали метод обратной транскрипции Мрнк интерферонов. Первыми добились результатов японские исследователи в конце 1979года. В 1980 г Гимберту и Вейсману удалось получить интерферон в генетически сконструированной E.coli, переработав 17 л они сумели выделить Мрнк и получить ее ДНК копию. Последнюю встроили в плазмиду и клонировали в клетках кишечной палочки. Аналогичные исследования проводились в Англии, Франции и России. В 1980 году были установлены нуклеотидные последовательности интерферонов альфа и бета. Мрнк фибробластного интерферона состоит из 836 нуклеотидов, из них 72 и 203 приходятся на 5 и 3 нетранслируемые области, 63 нуклеотида кодируют пептид, ответственный за секрецию интерферона из клеток и 498 нуклеотидов кодируют 166 аминокислотных остатков собственно интерферона. Путем химического синтеза были получены гены интерферонов альфа и бета, которые клонировали кишечную палочку. В 1981 г была расшифрована нуклеотидная последовательность иммунного интерферона. Полный синтез гена лейкоцитарного интерферона человека был впервые осуществлен в Германии.

Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов.

Индукция синтеза и выделение интерфероновой Мрнк из клеток

Получение ДНК комплиментрной интерфероновой Мрнк.

Встраивание полученной ДНК в плазмиду

Встраивание сконструированной плазмиды в клетки кишечной палочки

Размножение бактерий, содержащих сконструированную плазмиду

Сепарирование клеток E.coli

Дезинтеграция и экстракция клеток E.coli

Осаждение с последующим центрифугированием

Высаливание интерферона из супернатанта сульфатом аммония

Диализ осадка интерферона

Растворение интерферона. Пропускание раствора через колонку с иммунносорбентом

Элюация интерферона с последующим хроматографированием

Разработана методика получения человеческого интерферона с помощью B.subtillus, способной выделять синтезируемый белок в окружающую среду. Удается получить человеческий интерферон с помощью пекарских дрожжей,растущих на средах с более дешевыми субстратами. К преимуществам использования дрожжей можно отнести то, что на них не действуют бактериофаги, они крупнее бактерий, в их клетках осуществляется поцессинг преинтерферонов.