№29 Молекулярно-генетические методы обнаружения возбудителей инфекции в организме (днк и рнк зондирование, полимеразная цепная реакция).

В большей степени методы индикации НК нашли применение в диагностике вирусных инфекций, хотя существуют и спец системы для индикации некоторых прихотливых бактерий (легионелл, хламидий, энтерококков, микобактерий и др).

Наиболее распространены МЕТОДЫ ГИБРИДИЗАЦИИ ДНК И РНК. Принцип: ДНК (и РНК) способны специфически связываться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (РНК), меченых изотопами или ферментами (пероксидаза, ЩФ…). Затем образцы исследуют методом ИФА.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ. Была предложена в 1983г. Принцип: многократное образование копий (амплификация) определённого участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы. ЭТАПЫ:

1. ТЕРМИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 2-хнитевой ДНК на отдельные цепочки (93-95°С в течение 30 секунд).

2. ОХЛАЖДЕНИЕ СРЕДЫ И ВНЕСЕНИЕ ПРАЙМЕРОВ, комплементарных нуклеотидным последовательностям обоих цепочек. Используют синтетические праймеры – олигонуклеиды из 10-20 НКт, взаимодействующих с концами отдельных нитей исходной ДНК. Точнее добавляют 2 праймера (комплиментарны). Взаимодействие праймеров называют ОТЖИГОМ (реакция проходит за 20-60 с при 50-65°С).

3. Вносят СПЕЦ ТЕРМОСТАБИЛЬНУЮ ПОЛИМЕРАЗУ (оптимум 70°С), к/я синтезирует вторичные копии цепей ДНК (ампликоны).

4. Полученные 2-хнитчатые ДНК снова подогревают, остужают, вносят праймеры и т.д.

Т.к. полимераза устойчива к воздействию t°С, то нет необходимости постоянно её добавлять. После 30-80 циклов проводят идентификацию ДНК методом электрофореза. Подсчитано, что за 30-40 циклов из 1 матрицы образуется 100.000.000 (100 млн) ампликонов. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести ДНК-гибридизацию. ПЦР – оч чувствительный метод, теоретически достаточно иметь в среде лишь 1 молекулу ДНК.

Для ДИАГНОСТИКИ ИНФ ЗАБ-Й маркёром возбудителя явл его геном. Для амплификации отбирают какой-нибудь УНИКАЛЬНЫЙ ген, наиболее отличающий его от других патогенов.

№30 Биопрепараты для создания активного иммунитета. Вакцины, анатоксины. Принципы их получения.

Препараты для иммунопро­филактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний делятся на:

1. вакцины и анатоксины – для индукции специфического иммунного ответа с формированием активного противоинфекционного имму­нитета за счет мобилизации механизмов иммунологической па­мяти;

2. иммунные сыворотки и Ig – содержат готовые специфические АТ (Ig), введение которых в  приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции.

ВАКЦИНЫ (Э. Дженнер, Л. Пастер) – биопрепараты, предназначенные для создания активного искусственного иммунитета. Делятся на живые, убитые, химические, анатоксины и ассоциированные. Готовят т/же аутовакцины – из штаммов мк, выделенных непосредственно из  чка.

ЖИВЫЕ ВАКЦИНЫ создают напряжен­ный иммунитет, сходный с постинфекционным. Готовятся из АТТЕНУИРОВАННЫХ штаммов (т.е. вирулентные свойства утрачены, но при введении в  способны прижиться и вызвать выработку ВСЕХ ВИДОВ иммунитета). В большинстве случаев достаточно однократной вакцинации живой вак­циной, т.к. вакцинный штамм может размножаться и персистировать в . Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями → тяжелые инфек­ционные осложнения. Для получения используют следующие методы:

1. селекционный метод, направленный на выращивание мк в неблагоприятных условиях отбор микробов со ↓ вирулентностью – классический метод получения живых вакцин (Пастер – сиб язва).

2. Адаптация мк к  невосприимчивого Ж! или пассирование через ткани и органы, к/е не являются входными воротами для данного мк.

3. Отбор мутантных штаммов со ↓ вирулентностью, выделенных из природы.

4. Методы генной инженерии.

УБИТЫЕ ВАКЦИНЫ готовят из мк, обладающих максимально выраженной иммуногенностью. Их выращивают (на биопредприятиях), затем инактивируют t°С (55-60° в течение 1часа), УФ или хим в-вами (форма­лин, фенол, спирт и др) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Для профилактики – брюшного тифа, паратифов А и В, коклюша, бруцеллёза, лептоспироза… Для лечения – при вялотекущих и хронических инфекциях: бруцеллёз, туляремия, дизентерия, гоноррея, коклюш… Убитые вакциины создают ненапряжённый иммунитет.

Аттенуированный или убитый возбудитель – это множество различных АГ детерминант, но индуцировать защитный иммунитет могут немногие из них  очистить вак­цинный препарат от токсичных или аллергизирующих компо­нентов. Выделение из Б! АГ компонентов позволило получить вакцины второго поколения – ХИМИЧЕСКИЕ. По сравнению с др вакцинами они менее реактогенны. Аналогами Б! хим вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирионов (противогриппозная вакцина, включающая гемагглютинин и нейраминидазу). Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными.

Для ↑ ИММУНОГЕННОСТИ химических и субъединич­ных вакцин к ним добавляют разного рода адъюванты (adjuvans – помогающий, поддерживающий): гидрооксид алю­миния, алюминиево-калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавляют для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов.

АНАТОКСИНЫ получают путем обработки токсинов формалином (0,3% раствор) при температуре 37°С в течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез АТ. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, диф­терии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины.

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ:

1. получение в чистом виде эпитопов и их связывание с молекулой-носителем (природные белки, синтетические полиэлектролиты).

2. Генноинженерные методы: определяют гены, контролирующие нужные АГ детерминанты, переносят в геном других мк и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях.

3. На основе антиидиотипических анти­тел.

4. Использование липосом для введения АГ. Благодаря их сходству с клеточными мембранами они не токсичны для , заключенное в них вещество защищено от растворения в крови и они могут адсорбиро­ваться на клетках. Такие «липосомные» вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа.

Часть вакцин используется для обязательной ПЛАНОВОЙ ВАК­ЦИНАЦИИ детей: противотуберкулезная вакцина BCG, полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС.

Другие вакцины обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого энцефалита) или при опасности профессио­нальных контактов с возбудителем.

Общие требования к вакцинам: высокая иммуногенность, ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реак­ций), безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие.