Манило (метода)

ДНК, комплементарных исследуемой РНК, которые присутствуют в пробирке после каждого цикла реакции. Построим графики зависимости количества наработанных в ходе полимеразной цепной реакции копий ДНК от номера цикла ПЦР для каждого из образцов (рис. 2.6).

Рис. 2.6. Теоретические графики зависимости количества наработанных копий ДНК,

комплементарных исследуемой РНК, от номера цикла ПЦР. CqА и СqБ – циклы квантификации (quantification cycle, Cq) для образцов А и Б, определенные по пересечению графиков накопления продуктов ПЦР с линией, соответствующей пороговому уровню текущего количества продукта

На ранних циклах эффективность полимеразной цепной реакции близка к 100 %, поэтому происходит экспоненциальный рост количества продукта, по мере увеличения количества циклов эффективность амплификации уменьшается, поэтому накопление продукта становится линейным, а затем, в фазе «плато», прекращается вовсе. Поэтому в образцах, исходно содержащих разные количества матрицы, в фазе «плато» количество продукта может стать примерно одинаковым. Следовательно, по количеству продукта, измеренному в конечной точке, невозможно определить начальное количество матрицы (интересующее исследователя исходное количество РНК-мишени). Однако в фазе экспоненциального роста измеряемое текущее количество наработанных в ходе ПЦР копий молекул мишени зависит от начального количества матрицы. Эту зависимость в общем виде описывают уравнением:

где Nn – количество копий молекул мишени, наработанных к циклу n; N0 –

искомое количество молекул мишени до начала ПЦР; E – параметр, соответствующий средней эффективности для n циклов реакции. При эффективно-

41

сти ПЦР, равной 100 % (E = 1), за один цикл происходит удвоение текущего количества молекул мишени.

Таким образом, зная среднюю эффективность амплификации и количество копий мишени, наработанное к определенному циклу экспоненциальной фазы, можно найти начальное количество матрицы.

2.2.4. Метод определения значений циклов квантификации для сравнения начального количества матрицы в образцах

Рассмотрим один из подходов, позволяющий проводить сравнение начальных количеств матрицы в образцах, используя данные о количестве наработанного к определенному циклу продукта. Как видно из рис. 2.6, в образце А репортерная флуоресценция достигает некоторого порогового уровня через меньшее количество циклов, чем в образце Б. Таким образом, в экспоненциальной фазе, анализируя количество циклов, необходимых для достижения одинакового порогового уровня репортерной флуоресценции, можно сравнивать начальные количества мишени. Для этого необходимо выполнить следующие действия: 1) на графике накопления продукта ПЦР определить диапазон номеров циклов, в котором наблюдается экспоненциальный рост значений количества продукта; 2) в этом диапазоне выбрать некоторый пороговый уровень репортерной флуоресценции; 3) для каждого образца определить значение цикла квантификации (Сq, quantification cycle), при котором график накопления продукта ПЦР пересекает линию, соответствующую пороговому уровню, т. е. при этих номерах циклов во всех анализируемых реакциях достигаются одинаковые количества продуктов.

Прологарифмируем обе части уравнения (2.1) и преобразуем его к виду

Для n = Cq выражение (2.2) примет вид

Из выражения (2.3) следует, что если для всех анализируемых образцов эффективности реакций равны, а следовательно, равны параметры Е, и выбран один пороговый уровень текущего количества продукта ( NCq ), то вы-

42

Таким образом, определив значения Cq, можно сравнивать начальные количества мишени в различных образцах.

2.3.Источники ошибок измерений количества молекул РНК

испособы борьбы с ними

2.3.1. Технические ошибки, связанные с измерением количества молекул РНК с помощью ПЦР в реальном времени

Процесс определения количества молекул РНК в некотором биологическом образце с помощью ПЦР в реальном времени является косвенным измерением и состоит из многих этапов, начиная с выделения РНК и заканчивая статистическим анализом результатов амплификации (рис. 2.7). На каж-

Рис. 2.7. Схема, иллюстрирующая основные этапы измерения количества копий молекул РНК с помощью ПЦР в реальном времени и связанные с ними источники технических ошибок

43

дом из этапов могут быть допущены технические ошибки, влияющие на достоверность результатов измерения.

Ряда технических ошибок можно избежать, выполнив проверку свойств системы перед началом эксперимента. В частности, рекомендуется: проверять концентрацию и целостность РНК; проверять отсутствие ингибиторов ПЦР; проверять отсутствие продуктов амплификации в контрольной реакции об-

ратной транскрипции без обратной транскриптазы, а также в контрольной ПЦР без матрицы; оценивать эффективность амплификации, границы линейного участка калибровочного графика, а также адекватность выбора порогового уровня репортерной флуоресценции. Далее будет рассмотрено несколько дополнительных подходов для минимизации влияния технических ошибок.

2.3.2. Определение калибровочного коэффициента для анализа данных, полученных в ходе независимых запусков амплификатора

Входе эксперимента рекомендуется проводить измерение в максимально сходных условиях, т. е. выполнять амплификацию всех сравниваемых образцов одновременно с использованием одного набора реактивов и пластиковых пробирок. Чтобы минимизировать влияние неоднородности свойств нагревательного блока и оптической системы амплификатора, пробирки с образцами рекомендуется размещать в приборе в случайном порядке. Следует отметить, что амплификация разных РНК-мишеней, в частности исследуемой РНК и РНК, используемой для нормировки, может выполняться в ходе независимых запусков амплификатора.

Встандартных системах для амплификации в реальном времени одновременно можно амплифицировать до 96 образцов. При необходимости анализа конкретной мишени РНК в большом количестве образцов, приходится проводить несколько независимых запусков амплификатора. В этом случае могут возникать отклонения, связанные с изменением свойств нагревательного блока и оптической системы детекции амплификатора или настройками управляющей программы. Учесть возможные технические отклонения и сравнить результаты независимых амплификаций можно, если произвести амплификацию одного и того же дополнительного образца кДНК в ходе каждого из независимых запусков амплификатора. Такой образец называют межплашечным калибратором. Достаточно одного межплашечного калибратора для каждого флуоресцентного репортера. Однако использование нескольких межплашечных калибраторов повышает точность калибровки.

44

В качестве межплашечных калибраторов следует выбирать образцы, в которых концентрация исследуемой РНК существенно больше порога детекции системы и, следовательно, измерение Cq более воспроизводимо.

В общем случае, когда эксперимент выполнен в результате нескольких запусков амплификатора с использованием нескольких межплашечных калибраторов, значения Cq исследуемых генов, измеренные в результате конкретного запуска, корректируются с помощью калибровочного коэффициента. Данный калибровочный коэффициент рассчитывают, усредняя значения групп-калибраторов по всем калибраторам и/или по всем запускам (плашкам). Это необходимо потому, что невозможно определить, какой из запусков был более «правильным», к значениям какого запуска можно было бы привести результаты остальных амплификаций. Калибровку производят по следующей формуле:

плашке до и после калибровки; CqIPC – значение Cq в образцах калибрато-

рах; m – количество образцов калибраторов на калибруемой плашке; n – общее число образцов калибраторов на всех плашках.

Вчастном случае двух плашек и одного калибратора, для калибровки Cq

сплашек 1 и 2 используются следующие формулы:

где CqIPC1, CqIPC2 – значения Cq в образцах калибраторах на плашках 1 и 2 соответственно.

Таким образом, в результате межплашечной калибровки можно скорректировать значения Cq на всех анализируемых плашках.

Для определения абсолютного количества молекул РНК необходимо построение калибровочной кривой, для чего нужно амплифицировать образцы с известной концентрацией мишеней. В этом случае, чтобы избежать необходимости выполнения межплашечной калибровки, рекомендуется на каждой плашке наряду с исследуемыми образцами амплифицировать образцы, используемые для построения калибровочной кривой.

45

2.3.3. Повторные измерения

Еще одним подходом для минимизации влияния технических ошибок на измеряемое значение исследуемого параметра является усреднение значений повторных измерений в одном и том же образце. Результаты таких повторных измерений называют техническими репликатами. Используя данные литературы или результаты предварительного эксперимента, можно определить, какие из этапов эксперимента вносят наибольший вклад в разброс значений. Это позволит увеличить количество технических репликатов в основном эксперименте именно на этих проблемных этапах (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Схема эксперимента, при которой на каждом следующем этапе вводятся дополнительные репликаты

Индивидуальные биологические объекты, находящиеся в определенном состоянии и поэтому принадлежащие к конкретной группе, называются биологическими репликатами. Значение исследуемого параметра может зависеть также и от индивидуальных отличий биологических объектов, например от их пола или веса, влияниекоторыхнеинтересуетврамкахконкретногоисследования.

Такие отличия биологических объектов в составе одной группы также вносят существенный вклад в разброс измеренных значений исследуемого параметра. Увеличение количества биологических репликатов в каждой экспериментальной группе позволяет минимизировать влияние неинтересующих индивидуальных отличий биологических объектов.

46

2.3.4. Нормировка (нормирование) измеренных значений

Цель количественного анализа РНК в биологическом образце – измерение количества копий в одной клетке или в единице объема биологической жидкости, например плазмы крови. Поэтому необходимо определить не только количество копий РНК, но и относительное или абсолютное количество клеток или объем биологической жидкости, из которых эта РНК была выделена. Затем необходимо выполнить нормировку измеренных значений количества РНК в каждом образце, чтобы полученные нормированные значения соответствовали одинаковому количеству клеток/биологической жидкости.

Объем биологической жидкости можно достаточно точно измерить с помощью автоматической пипетки. Информацию об относительном количестве клеток в образце можно получить, определив его массу. Однако точное взвешивание образцов сопровождают определенные технические сложности, поэтому распространены альтернативные подходы по оценке количества клеток. Клетки определенного типа содержат примерно одинаковое количество общей РНК. Кроме этого, количество общей РНК в клетке обычно устойчиво к экспериментальным воздействиям, так как такие воздействия существенно изменяют концентрации только ограниченного количества конкретных РНК, которые составляют малую часть общей РНК. Общее количество РНК выделенное из биологического образца можно достаточно точно измерить с помощью спектрофотометрии или флуориметрии и использовать для оценки количества клеток, содержавшегося в образце.

Однако взвешивание, измерение объема биологической жидкости или измерение количества общей РНК позволяют оценить только стартовое количество биологического материала. Тем не менее, в процессе выделения РНК и проведения ферментативных реакций появляется дополнительная вариабельность между образцами, связанная с такими техническими факторами, как ошибки пипетирования, деградация РНК и присутствие ингибиторов ПЦР. Для учета этих изменений применяются подходы, основанные на предположении, что индивидуальные РНК в образце ведут себя сходным образом. А именно, если технические факторы привели к уменьшению количества конкретной РНК в образце в 2 раза, то и измеряемое количество всех остальных РНК в этом образце уменьшилось в 2 раза. Таким образом, РНК, количество которой в клетке или единице объема биологической жидкости не зависит от экспериментальных условий, можно использовать для корректировки изменений количества остальных РНК. Такую РНК называют референсной

47

РНК. Использование усредненных значений измеренных количеств нескольких референсных РНК может улучшить результаты нормировки, так как позволяет минимизировать вклад индивидуальных случайных отклонений.

Итак, для того чтобы некоторую эндогенную РНК можно было использовать в качестве референсной, необходимо выполнение двух требований: 1) независимость количества референсной РНК от экспериментальных условий, 2) равенство эффективностей амплификации референсной и исследуемой РНК.

Для проверки выполнения первого условия проводят эксперимент, в ходе которого в исследуемых образцах после предварительной нормировки на общую РНК выполняют амплификацию РНК, претендующую на роль референсной. В качестве объективного критерия для анализа измеренных Cq используют дисперсионный критерий (ANOVA). Если в результате однофакторного дисперсионного анализа обнаружены различия значений Cq для референсной РНК хотя бы в одной экспериментальной группе, то в этом случае анализируемая РНК не может использоваться как референсная РНК.

Для проверки равенства эффективностей амплификации референсной и исследуемой РНК проводят эксперимент, в ходе которого в серийных разведениях матрицы амплифицируют исследуемую и референсную РНК. Определяют значения Cq всех мишеней и далее для каждого разведения вычисляют разность Cq исследуемой и референсной РНК. Затем строят линейную регрессию для зависимости разности Cq от разведения. Если коэффициент наклона линии регрессии не превышает по абсолютному значению 0.1, то эффективности амплификации признаются равными и соответствующую референсную РНК можно использовать для нормировки.

Если среди присутствующих в клетке РНК не удается найти референсную, то можно применить более универсальный подход – перед выделением РНК к одинаковым объемам биологической жидкости или фрагментам ткани одинаковой массы вместе с лизирующим буфером добавляют одинаковые количества синтетической РНК, которую в этом случае называют добавочной. Добавочную РНК выбирают таким образом, чтобы ее длина была сравнима с длиной исследуемой РНК, а нуклеотидная последовательность не встречалась в геноме исследуемого организма. Амплификация референсной или добавочной РНК позволяет учесть изменения в измеренных количествах исследуемой РНК, обусловленные техническими факторами этапов выделения РНК и проведения ферментативных реакций.

48

Таким образом, в зависимости от характеристик биологических образцов, экспериментального воздействия и свойств анализируемых РНК исследователь может выбрать следующие стратегии нормирования:

1)на массу ткани, количество культивируемых клеток или объем биологической жидкости;

2)на общую РНК;

3)на референсную РНК;

4)на добавочную РНК.

Вподходах 1 и 2 нормировка осуществляется на этапе пробоподготовки,

ас помощью ПЦР измеряется только количество исследуемой РНК. В подходах 3 и 4 для нормировки необходимо дополнительно определять количество референсной или добавочной РНК с помощью ПЦР. Часто нормировку выполняют комбинируя подходы 1 и 4 при работе с биологическими жидкостями и подходы 2 и 3 при работе с фрагментами тканей или культурами клеток.

2.4. Словарь терминов и понятий

Добавочная РНК – синтетическая РНК, одинаковое количество которой добавляется к равным количествам клеток или равным объемам биологических жидкостей перед выделением из них общей РНК; может быть использована для нормировки.

Исследуемая РНК / РНК-мишень / исследуемый транскрипт – эндоген-

ная РНК, абсолютное или относительное количество которой в клетке или в единице объема биологической жидкости необходимо определить.

Калибровочный график – график зависимости номера цикла квантификации от логарифма начального количества матрицы.

Количественная ПЦР в реальном времени – ПЦР, в которой текущее ко-

личество продукта измеряется после окончания каждого цикла. Контрольная ПЦР без матрицы – реакция синтеза дополнительных ко-

пий определенных фрагментов молекул ДНК, в которой присутствуют все необходимые компоненты кроме матрицы ДНК или кДНК.

Контрольная реакция без обратной транскриптазы – реакция синтеза ДНК на матрице РНК, в которой присутствуют все необходимые компоненты, кроме обратной транскриптазы.

Межплашечный калибратор – аликвоты одного образца кДНК, амплифицированные в ходе независимых запусков амплификатора.

Обратная транскрипция (ОТ) – ферментативная реакция, в процессе которой синтезируются ДНК-копии определенных молекул РНК.

49

Общая РНК – совокупность всех молекул РНК, выделенных из клеток биологического образца, включая матричные РНК и регуляторные некодирующие РНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – ферментативная реакция, в про-

цессе которой синтезируются дополнительные копии определенных фрагментов молекул ДНК.

Продукт ПЦР – дополнительные копии определенных фрагментов молекул ДНК, синтезированные в ходе ПЦР.

Праймер – одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид, комплементарный участку исследуемой молекулы РНК или ДНК, необходим для начала матричного ситнеза с помощью ДНК-полимеразы.

Репортерная флуоресценция – флуоресценция красителя, интенсивность которой прямо пропорциональна присутствующему в реакции в данный момент количеству копий двухцепочечной ДНК.

Референсная РНК / референсный транскрипт – присутствующая в клетке или биологической жидкости РНК, количество которой не зависит от экспериментальных условий и поэтому может быть использована для нормировки.

Цикл квантификации (Сq) – номер цикла, при котором график накопления продукта ПЦР пересекает линию, соответствующую некоторому пороговому уровню репортерной флуоресценции.

Эффективность амплификации – параметр реакции амплификации, указывающий, во сколько раз увеличивается количество продукта ПЦР за один цикл реакции; при эффективности амплификации 100 % за один цикл происходит удвоение текущего количества молекул мишени.

50