24 Продуценты витамина в12.Условия образования их в клетках продуцентов. Микробиологическое производство и применение витамина в12.

Продуценты витамина В₁₂. В природе В₁₂ и родственные корриноидные соединения входят в клетки микроорганизмов, некоторых животных, высших растений. Из микроорганизмов активными считаются представители рода Propionibacterium. Природный источник образования 1- 8,5 мг/л корриноидов. Мутационный штамм P.schermanii способны продуцировать до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriacea есть другие представители продуцирующие В₁₂: Eubacterium limosum ( Butyribacterium ruttgerii). Практический интерес представляют актиномицеты и родственные микроорганизмы. Истинный В₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardia rumosa. После мутации были получены штаммы, накопляющие до 18 мг/л В_12. Активные продуценты витамина В₁₂ были обнаружены среди представителей рода Micramonospora.

Высокой кобаломинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Metanosarcina bacterii, M.vacuolata, Methanococeus halofhilus. Кроме того корреноиды синтезируются строгими анаэробами clostcidium titanomorfum, Cl.sticklandii. Активными продуцентами витамина В₁₂ являются Pseudomomas denitrificans. Мутантный штамм МВ2436 на оптимизированной среде синтезируют до 59 мг/л корреноидов. Он используется в промышленном получении витамина В₁₂ фирмой Мэрк. Значительное количество витамина В₁₂ образуют цианобактерии, хлорелла. Продуценты культивируются на средах, приготовленных на основе пищевого сырья (соевая мука, рыбная мука, мясной, кукурузный экстракт). Особое внимание уделяется микроорганизмам, синтезирующим корреноиды при утилизации непищевого сырья. Например, Achromobacter sp. утилизирует изопропиловый спирт как источник углерода и энергии и накапливают до 1,1 мг/л провитамина В_12. Pseudomonas sp. способны синтезировать В₁₂ в среде с метанолом и пропандиолом, накапливая до 160 мкг/л.

В среднем в мире выпускается 10000 кг В₁₂: половина используется для медицинских целей, половина в животноводстве. Продуцентами являются пропионовокислые бактерии ( Россия, Великобритания, Венгрия), мезофильные, термофильные, метаногенные бактерии (Россия, Венгрия), актиномицеты и родственные им формы ( Италия). В России промышленные продуценты Propionibacterium freudenreichii var shermanii культивируют в периодических условиях на среде, содержащий кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта, сульфат аммония. Образующиеся в процессе кислоты нейтрализуют раствором щелочи, непрерывно подаваемой в ферментер. Через 72 часа от начала культивирования в среду вносят предшественник 5,6-диметилбензиндозол. Без добавления этого предшественника бактерии будут синтезировать фактор В и псевдовитамин В₁₂ не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 часа. Витамин находится в культуре бактерии поэтому по окончании брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5-5 при 85-90ºС в течении 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора NaNO₂ с конц. 0,25%. Водный раствор В₁₂ охлаждают, доводят до рН 6,8-7,0 50% раствором NaOH, к раствору добавляют Al₂(SO₄)₃·18Н₂О и безводный FeCl₃ для коагуляции белка. После чего фильтруют через фильтр-пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле, с которой кобламины элюируют растворам аммиака. Дополнительно очищают раствор витамина органическими растворителями, упаривают и чистят на колонке с Al₂O₃. с окиси алюминия кобламины элюируют водным раствором ацетона. Истинный В₁₂ отделяют от его других форм. К вводно-ацетоновому раствору добавляют ацетон и выдерживают при 3-4ºС 24- 48 часов. Выпавшие кристаллы промывают сухим ацетоном и серным эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Эти операции проводят в затемненном помещении или при красном цвете, чтобы не разложился витамин. Концентрат ционкобламина обрабатывают водным раствором резорцина или фенола. Выделяют комплекс В₁₂ с резорцином или финолом, разлагают его и получают кристаллический препарат. Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобламина. Селекционные работы над пропионовокислыми бактериями направлены на выделение высоко продуктивных штаммов, растущих на дешевом, непищевом сырье. Пропионовокислыми бактериями и выделенным В₁₂ обогащают кисломолочную продукцию. Для этого готовят концентрат на молочной сыворотке пропионовокислых бактерий. Для животноводства В₁₂ получают на смешанной культуре из термофильных, метанобразующих бактерий. Субстратом служит мелассная зерна-картофельная барда технология получения включает стадии:

1. непрерывное смешивание барды комплексом бактерий;

2. сгущение метанольной барды;

3. сушка сгущенной массы на распылительной сушилки.

Брожение ведут в железобетонном ферментере непрерывным способом в течение года. Нормальными условиями процесса брожения является постоянный контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота в среде. Учитывая, что В₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, перед выпариванием к метанольной бражке добавляют HCl до оптимального рН 5,0-5,3 и Na₂SO₃ оптимальное содержание 0,07-0,1%. Перед упариванием метанольную бражку дегазируют путем нагревания до 90-95 ºС при атм.

давлении. Бражку сгущают до 20% СВ в четырехкорпусной выпарной установки. Сгущенную метанольную бражку высушивают на распылительной сушилки. Готовый продукт фасуют в полиэтиленовые пакеты, вложенные в крафт-пакеты. Технология экономична из-за доступности сырья, непрерывности метода, натребует стерильных условий, отсутствуют отходы.

25 Получение азотфиксирующих препаратов. Свойства клубеньковых бактерий. Роль клубеньковых бактерий в азотном балансе почвы. Препараты клубеньковых бактерий. Стадии производства, применение препаратов клубеньковых бактерий и других азотфиксаторов.

интенсивное возделывание хозяйст. культур обедняет почву по азоту. Повышает содержание азота в почве культивирование бобовых растений, что связано с их симбиозом с клубеньковыми бактериями, способными фиксировать азот воздуха и переводить его в аммонийную форму, легко усваиваемую микроорганизмами почвы и растений. Азотфиксирующие бактерии подразделяются на клубеньковые и свободноживущие в почве.

Клубеньковые азотфиксирующие бактерии защищены от кислорода мембраной клубеньков, так как фермент нитрогеназа ответственный за фиксацию азота из воздуха очень чувствительный к микроколичеству кислорода и ингибируется им. Свободноживущие азотфиксирующие бактерии имеют собственную защиту нитрогеназы в клетках, за счет нее локализуется в конкретных органеллах мембраны, которая не допускает попадание кислорода внутрь, и внутри которой происходит реакция азотфиксации. На корнях растут бактерии рода Rhizobium и Bradirhizobium видовое название соответствуют роду растения на корнях которого они образуют клубеньки. Такое деление условно так как на корнях большого числа видов бобовых растений могут существовать одни и те же виды Rhizobium. Клубеньковые бактерии в молодых культурах палочковидные размер 0,5-0,9 ÷ 1,2-3,0 мкм. В некоторых условия клетки могут быть овальной, кокковидной, грушевидной, разветвленной. Многие глубеньковые растения в молодом возрасте содержат подвижные бактерии. Передвижение за счет перетрихально расположенных жгутиков, грамм отрицательны, в качестве запасного продукта могут образовывать поли-н-гидрогкибутират. Размножаются делением. Подразделяются на быстрорастущие ( горох, клевер, люцерна, фасоль, бобы, донник), медленнорастущие (люпин, соя, арахис, т.д). Растут в чистых культурах на средах с углеводами и другими алигосахаридами. Считается, что все клубеньковые растения нуждаются для роста в молекулярном кислороде, хотя способны развиваться в микроаэробных условиях. Для разных видов т. от. 25-35ºС, рН опт. 6,8-7,0. количество бактериальных клеток, необходимых для инфицирования одного растения велико и (500—млн. на одно семя), нов ткани корня попадает только единичные клетки. Бактерия узнает своего хозяина при помощи гликопептида – легтина, расположенного на корневых волосках при внедрении Rhizobium в корневой волос образуются инфиксационные нити в которых находятся и размножаются бактерии. Эти нити проникают в кору корня и достигают тетроплоидных клеток, после чего формируются клубеньки.. Клубеньки появляются во время развития первых настоящих листьев у однолетних растений. Функционируют не долго. Некроз начинается во время цветения растения. Часть бактероидных клеток лизируется, другие попадают в клетку в виде кокков. фиксация молекулярного азота клубеньковыми бактериями ведет к образованию NH₃, который идет на синтез аминокислот. При фиксации азота идет выделение молекулы водорода.

Интенсивная эксплуатация земель приводит к снижению плодородия, по имеющимся данным с урожаем зерновых ежегодно выносится из почв 50-90 кг азота на каждые 10 ц. зерна. Пополнить азотное питание можно за счет различных источников

. При возделывании бобовых в больших количествах минеральноазотные удобрения не применяются, используют только их небольшие стартовые дозы 25-30 кг/га, необходимые растения в начальной фазе роста. Биологический азот ассимилируется полностью в отличии от минерального. Минеральный подвергается вымыванию, денитрификации и может улетучиваться в виде N₂O и NO. Эффективность усвоения 50% кроме того биологический азот не загрязняет окружающую среду вредными примесями.

эффективный метод при котором с корней бобовых растений собирались клубеньки, высушивались, измельчались, смешивались с тальком или бентонитом, обрабатывали семена бобовых растений перед посевом. В препарате содержатся различные по азотфиксирующей активности бактерии и посторонние микроорганизмы. Для приготовления препарата клубеньковых растений их можно выращивать на средах представляющих собой отвары бобовых культур ( гороха, фасоли, безалколоидного липина) дополнительно вносит углеводы (глюкоза, сахароза) либо манит. Носителями могут быть агар (дорог для промышленного производства) почва, торф, активированный уголь, бантонит, цеалит, навоз, но они оказались менее благоприятными, чем торф. Принципиальная технологическая схема производства ризоторфина включает стадии:

1. выращивание и хранение культуры клубеньковых бактерий;

2. получение жидкой культуры (инокулята);

3. подготовка торфа;

4. стерилизация;

5. инокуляция и хранение препарата;

6. контроль производства.

Наиболее распространенным методом инакуляции бобовых растений является предпосевная обробатка семян препаратами клубеньковых растений, при этом семена увлажняют, добавляют 2-2,5% воды от их массы, затем добавляют ризоторфин, тщательно перемешивают в устройствах предназначенных для протравливания семян. Обработку ведут в день посева. Применяют другой способ инакуляции: ризоторфин суспензируют с небольшим количеством воды и этой суспензией обрабатывают семена. Были попытки применения других способов инакуляции то есть обработка корней проростков, нанесения культуры бактерии на цветки бобовых и внесение большого количества препарата в почву. В этих случаях более удобной формой оказался гранулированный препарат который вносили в почву вместе с семенами. Недостаток огромный расход препарата несколько десятков кг /га. Были попытки внесения суспензии КБ в почву глубже расположения высеваемых семян. Проблема – конструкции сеялок, для которых требуется дополнительные приспособления.

В почвах богатых органическим веществом среди микроорганизмов ведущее место занимает Azotobacter активно фиксирующие молекулярный азот.. Благотворное влияние Azotobacter на растения определяется не только фиксацией молекулярного азота из воздуха, но и действием образуемых им БАВ, относящихся к стимуляторам роста, витаминов, антибиотиков. Жидкой культурой Azotobacter обрабатывали корни рассады растений, но широкомасштабного использования такой подход не имеет. Эффективные результаты получены при использовании ассоциативных азотфиксаторов. Их получают на основе препаратов состоящих из других азотфиксаторов, например, бактерий рода Azospirillum, которые обитают на корнях и зеленых частях растений, участвующих в активной фиксации азота. Особенно значительный эффект был достигнут для кукурузы, сахарного тростника, проса. В южных странах в качестве зеленых удобрений используется водный папоротник Azolla. Это симбиоз папоротника и азотфиксирующих цианобактерий Anabaena azolloe, которые живут в полости листьев. Исследования показали принципиальную возможность получать с помощью азотфиксирующих цианобактерий аммиак из азота в промышленных условиях. Для этого используют фототрофные пурпурные бактерии и цианобактерии. Обе способны к фиксации молекулярного азота в результате конверсии энергии света.