I. Среды для культивирования микоплазм

1.1. Модифицированная среда Хайфлика. Среда пригодна для культивирования большинства видов микоплазм.

Настой говяжьего сердца (Difco) - 2,85 г, дистиллированная вода - 90 мл. Стерилизовать автоклавированием (121°С, 20 мин, 1,5 атм.). Добавить сыворотку крови лошади - 20 мл, свежий 25% экстракт дрожжей - 10 мл, ДНК (Sigma) - 1,2 мл, таллия ацетат (1% раствор) - 1 мл, пенициллин; рН 7,7. Для приготовления агаризованной среды добавить перед автоклавированием 1,4 г очищенного агара (L28, Oxoid) либо 0,6 - 0,8% агара Нобеля (Difco).

1.2.Среда5Р-4

Среда пригодна для выделения и культивирования плохо растущих видов микоплазм человека (М, pneumoniae, M. genitalium, M. fermentans шт. incognitus)

Микоплазменный бульон (Bacto PPLO broth, Baltimor Biological Laboratiries) - 1 г, бактопептон (Difco) - 1.6 г, бактотриптон (Difco) - 3 г, деионизированная вода - 197 мл; довести рН до 7,8 (берут 0,6 мл 2Н раствора NaOH). Стерилизовать автоклавированием (121°С, 30 мин, 1,5 атм.). Добавить: индикатор - 0,5% раствор фенолового красного - 1,2 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл - 3 мл, 2% раствор препарата дрожжей (Yestolate), пропущенный через фильтр с порами 450 и 220 нм, - 30 мл, среду для культивирования клеток позвоночных CMRL - 1066 (х10) с глутамином, но без NaHCО₃ (Gibco) - 15 мл, 25% свежий дрожжевой экстракт (Flow Laboratories) - 10.5 мл, сыворотку эмбриона коровы, прогретую в течение 1 ч при 56 °С - 50 мл, 50% раствор глюкозы - 3 мл; рН 7,4. Готовую среду пропустить через фильтр с порами 220 нм.

1.3.Среда, разработанная Г.Я. Каган и используемая в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва). Триптический гидролизат мышцы говяжьего сердца - 200 мл, мясная вода - 400 мл, 25% дрожжевой экстракт - 100 мл, NaCI 0,5%, вода водопроводная - 300 мл. Добавить сыворотку крови лошади - 20 мл, 40% раствор аргинина - 2%, 40% раствор глюкозы - 1%, пенициллин из расчета 100 ЕД/мл (конечная концентрация), таллия ацетат 1:2000 (конечная концентрация). Для трудно культивируемых штаммов рекомендуется добавлять : 25% раствор пептона - 2%, комплекс витаминов для среды Игла - 0,002%, ДПН, либо НАД - 0,002%. НАД, ДПН, таллия ацетат и аргинин разводят в дистиллированной воде, стерилизуют фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. РН 7,8. Для приготовления агаризованной среды добавить перед автоклавированием агар - 0,3% (полужидкая среда) или 1,3% (полутвердая среда),

Гидролизат сердечной мышцы готовить следующим образом: к 1 части измельченного мяса добавить 1,5 части воды, кипятить 10 мин, полусваренную массу пропустить через мясорубку; рН отвара довести до 7,8 - 8,0. К 10 л отвара добавить б кг фарша, 1,5 кг поджелудочной железы и 300 мл хлороформа. Ферментация - 10 дней при 46 °С, затем фильтровать; рН 7,0.

1.4. Среда на основе гидролизата Р-глобулиновой фракции, полученной из отходов гамма-глобулинового производства.

Гидролизат Р-глобулиновой фракции получают путем добавления к Р-глобулинам 10% гомогенной массы поджелудочной железы крупного рогатого скота или свиньи и 1% хлороформа. Ферментация при рН 7,8 - 7,9 72 ч. при 37 °С с периодическим встряхиванием. Полученный гидролизат фильтруют, консервируют хлороформом и хранят при 4 °С до употребления. Этот препарат используют в качестве основы для жидкой и полутвердой питательных сред. При этом его разводят водопроводной водой до следующих стандартов: общий азот - 380 - 450 мг%, аминный азот - 280 -300 мг%. К основе добавляют: 25% дрожжевой экстракт - 10%, глюкозу - 0,5%, глицерин - 0,5%, NaCI - до 0,5%. РН 7,8 - 8,0. Стерилизовать автоклавированием (121 °С, 20 мин, 0,6 атм.). Добавить сыворотку крови лошади или человека - 20%, холестерин - 0,05 - 0,1%, пенициллин - 500 ЕД/мл.

2. Среды, используемые для выделения и культивирования уреаплазм.

2.1. Бульон, содержащий мочевину и индикатор (Urease color test broth U 9C)

Триптиказосоевый бульон BBL №11768 - 1,5 г или триптический перевар ВВ № 11754 - 1,5 г, MgCl₂ x 6H₂0 = 0,02 г, дрожжевой экстракт (Difco № 0127) - 0,1 г, деионизированная вода - 90 мл, довести рН до 5,5 (берут 2Н раствор НСl) , стерилизовать автоклавированием (121 °С, 15 мин, 1,5 атм.). Добавить: сыворотку крови лошади (неинактивированную) - 10 мл, мочевину (10% р-р)- 0,3 мл, L-цистеин - НС1 (2% р-р) - 0,5 мл, GHL- трипептид (глицил-L-гистидил-L-уксусный лизин (Calbiochem Behring) раствор из расчета 20 мг/мл - 0,1 мл, феноловый красный (1% автоклавированный р-р) - 0,1 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл. - 0,1 мл. Мочевину, L-цистеин - НСl и раствор трипептида стерилизовать фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. Хранить при -20 °С.

Изменение цвета среды от желтого до розового или красного при сохранении прозрачности бульона свидетельствует о росте U. urealyticum и наличии уреазной активности,

2.2. Бульон, содержащий мочевину и индикатор - среда 10С

Бульон PPLO (PPLO broth W/o CV, Difco) - 1,47 г, деионизированная вода - 70 мл;

довести рН до 5,5 (берут 2Н раствор НС1) и стерилизовать автоклавированием (121⁰С, 15 мин, 1,5 атм). Добавить: сыворотку крови лошади (неинактивированную) - 20 мл, 25% водный экстракт сухих дрожжей - 10 мл,, L-цистеин - НСl (2% р-р) - 0,5 мл, мочевину (10% р-р)- 0,4 мл, раствор, содержащий стимуляторы роста, витамины и аминокислоты (CVA, Cat. № D-1000, D-1500), раствор трипептида GHL (из расчета 20 мг/мл) - 0,1 мл, феноловый красный (1% автоклавированный р-р) - 0,1 мл, пенициллин из расчета 100 000 ЕД/мл. - 0,1 мл. Мочевину, L-цистеин - НСl и раствор трипептида стерилизовать фильтрованием через фильтр с порами 220 нм. Хранить при -20 С.

Изменение цвета среды от желтого до оранжево-красного при сохранении прозрачности бульона свидетельствует о росте U. urealyticum и наличии уреазной активности.

2.3. Стандартная агаризованная среда А5К

Триптиказосоевый бульон BBL - 2,4 г, деионизированная вода - 80 мл, рН доводят до 5,5 (берут 2Н раствор НС1), агар Gibco. Стерилизовать автоклавированием (121⁰С, 15 мин, 1,5 атм.). Добавить то же, что и к среде 10С.

2.4 Дифференцировочные агаровые среды А7 и А8.

Эти среды готовят и стерилизуют так же, как среду А5К.

Добавить в качестве индикатора к среде А7 MnS0₄ х 6Н₂0 - 0,03% или к среде А8 CaCl₂x2H₂0- 0,014%.

Колонии уреаплазм окрашиваются в темно-коричневый цвет. При этом колонии М hominis не окрашиваются.

2.5. В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН используют бульон и полутвердый агар, приготовленные на основе триптического первара сердечной мышцы (см. 1.3). Стерилизация автоклавированием (121⁰С, 30 мин, 1,5 атм.). После автоклавирования добавить: феноловый красный - 0,003%, мочевину - 0,05%, сыворотку крови лошади - 20%, пенициллин - из расчета 1000 ЕД/мл. Для приготовления агаризованной среды добавить 1.3% агара.

2.6. Фирма Bio Merieux (Франция) предлагает для выделения М. hominis и U. urealyticum готовые наборы питательных сред ("Mycoplasma - Lyo").

П. Приготовление диагностикума для РАГА.

Эритроциты крови человека (группа 0(1), резус-отрицательная) тщательно отмывают от сывороточных белков изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендируют до 8% концентрации и добавляют 25% водный раствор ГЛА (фирма "Serva") до его конечной концентрации (0,25%). После инкубации в течение 3 ч при 37 °С эритроциты отмывают 4 раза ресуспендируют в нем, добавляют ГЛА до его конечной концентрации (0,25%). Гипериммунную сыворотку кролика (специфические антитела) в количестве 1 мл смешивают с 80 мкл 2,5% раствора ГЛА в изотоническом растворе хлорида натрия) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С, затем соединяют с осадком эритроцитов, отмытым изотоническим раствором хлорида натрия и полученным из 1 мл 8% стабилизированной взвеси. В эту смесь вводят МаНСОз (до конечной концентрации 2%) и инкубируют при 56 °С 1 час 30 мин в условиях водяной бани. Сенсибилизированные таким образом эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия и ресуспендируют в 10 мл этого раствора. Для консервации вносят мертиолят (конечная концентрация 1:10 000) и хранят при +4 °С. Полученный эритроцитарный диагностикум (тест-эритроциты) сохраняет свою активность в течение 1 мес.

III Приготовление диагностикума для РПГА. Для постановки реакции используют стабилизированные и активированные глютаровым альдегидом эритроциты человека, имеющего 0(1) группу крови, резус-отрицательную, сенсибилизированные растворимым антигеном микоплазм. Антиген представляет собой центрифугат ультразвукового дезинтеграта биомассы микоплазм (2х10⁸ КОЕ/мл); для сенсибилизации используют раствор антигена в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащий белок (2 мг/мл).

8% взвесь стабилизированных эритроцитов (1 мл) отмыть трижды, суспендировать в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и внести 10 мл раствор танниновой кислоты в разведении 1:50 000. После инкубации в течение 30 мин при 37 °С отмыть их 3 раза, ресуспендировать в 10 мл изотонического раствора хлорида натрия и внести равный объем предварительно оттитрованной дозы антигена (в разведении 1:40 - 1:160). Инкубировать в течение 30 мин при 37⁰С и после однократного промывания в изотоническом растворе хлорида натрия в десятикратном объеме ресуспендировать в 10 мл этого же раствора, внести в качестве консерванта мертиолят (конечная концентрация 1:10 000). Хранить при +4⁰С,

Литература

1. Васильева Е.В. и др. Оценка этиологической роли микоплазм, уреаплазм и хламидий в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта. // Опыт диагностики и лечения больных /ЦКБ МПС России,- М. 1997, стр. 125 - 127.

2 Герасимова Н.М. и др. Применение кларитромицина (клацида) в терапии больных с урогенитальным хламидиозом и уреаплазмозом.// Акт. Вопр. Инфекций, передаваемых половым путем, у детей, подростков и беременных. Уральск. НИИ Дерматовенерологии МЗ РФ, 1999, стр. 185-186.

3. Игнатова И.Г. и др. Опыт применения циклоферона в лечении урогенитальных микоплазмозов. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии», Кемерово, 1998, стр. 18-19.

4. Кузнецов В.П. и др. Инфекционные агенты в этиологии хронических сальпингоофоритов в разработке комплексной терапии с лейкинфероном.// Вестник дерматологии и венерологии, 1994, №4 стр. 22 - 25.

5. Покровский В.И. и др. Этиология, диагностика и этиотропная терапия острых пневмоний. М. «Медицина». 1995 стр. 226 -265.

6. Прозоровский С.В. и др. // Медицинская микоплазмология», М., «Медицина», 1995.-225 с.

7. Раковская И.В., Вульфович Ю.В. // «Микоплазменные инфекции урогенитального тракта», Ассоциация САНАМ, М., 1995.- 66 с.

8. Соловьев С.В. и др. Выявление тетрациклин- и эритромициноустойчивых штаммов урогенитальных микоплазм с помощью ПЦР. ЖМЭИ, 1998. №6, стр. 3-7.

9. Цинзерлинг А.В., Вуду Г.А. «Внутриутробный микоплазмоз».- Кишинев. (Штиинца».- 1986.- 189с.

10. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: Sophisticated, Reemerging and Burdened by their Notoriety // Emerging Infect. Dis. 1997, vol.3., №1, p.21 - 32

11. Methods of Mycoplasmology. Ed. T.G. Tully, Sh. Rasin. Academic Press.- 1983.- p. 439.