2.5. Методы переноса генов в живые клетки

Выше в общих чертах была описана методика введения рекомбинантных плазмид в клетки бактерий E.сoli для клонирования генов. Однако клетки животных и, особенно, растений существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК. Так, растительные клетки имеют жесткие целлюлозные оболочки, преодолеть которые весьма непросто. В связи с этим проблема разработки методов переноса генов в живые клетки всегда была и остается в центре внимания специалистов в области генетической инженерии. Надо признать, достижения в ее решении весьма впечатляющи. Тем не менее, остается много нерешенных проблем, касающихся, например, сайт-специфического встраивания трансгенов в ДНК высших организмов, повышения эффективности переноса трансгенов для многих видов и др. Ниже описаны основные методы переноса генов в живые клетки, которые в настоящее время применяют в генно-инженерных работах.

. 2.5.3. Перенос генов в клетки растений

Характерной особенностью растительных клеток является наличие вокруг них жесткой целлюлозной оболочки, которую никаким микрокапиллярами не проткнешь. Поэтому для их трансформации используют специфические методы. Тем не менее, с целью обеспечения возможности применения обычных для микробов и животных клеток методов трансформации разработаны эффективные методы ферментативного растворения целлюлозных оболочек. В результате получают так называемые протопласты, способные при определенных воздействиях (химических и электрических) сливаться между собой, а также интегрировать чужеродную ДНК.

Для трансформации растительных протопластов применяют хорошо известные по бактериям методы стимуляции этого процесса с помощью CaCl₂, а также полиэтиленгликоля. Очень эффективным методом оказалась и электропорация. Весьма перспективной рассматривается методика введения чужеродной ДНК в протопласты с помощью микроинъекций. Созданы даже компьютерные системы, соединенные с микроскопом, обеспечивающие достаточно легкое обнаружение, прикрепление и перемещение отдельных протопластов и микрокапилляров, через которые вводят ДНК в клетку.

Однако основная проблема в трансформации протопластов растений – возможность ее использовать лишь для ограниченного числа видов растений, для которых разработаны эффективные методы выделения, культивирования протопластов и получения из них растений-регенератов (подробнее об этом ниже).

Среди методов прямого переноса генов в растительные клетки наибольшее распространение получил метод биологической баллистики (биолистики), или как его еще называют, бомбардировки частицами (particle bombardment), генного дробовика (gene gun technique). Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частицы (диаметром 0,4-1,7 мкм) из вольфрама или золота напыляют рекомбинантные ДНК, содержащие предназначенные для переноса гены с необходимыми регуляторными элементами. Эти частицы разгоняют до огромной скорости (300-600 м/сек) в специальном пневматическом аппарате («генной пушке») и помещают на их пути растительные ткани (меристемы, незрелые зародыши, колеоптили, протокормы, пыльцу) или культуры клеток (каллюс или суспензию клеток). В результате частицы проникают в клетки, а чужеродная ДНК встраивается в ДНК хромосом или органелл (Рис. 2.9). Несмотря на ряд недостатков (нежелательная для трансформации растений многокопийность вставок, разрушение части вносимых генных конструкций и др.), метод биолистики является основным для получения трансгенных однодольных растений, среди которых все злаковые культуры, а также многих двудольных растений, которые являются некомпетентными или слабо компетентными для основного метода введения генов в растительные клетки – агробактериальной трансформации.