2.2. Методы создания рекомбинантных молекул днк

Технологию рекомбинантных ДНК можно использовать для манипуляций с фрагментами ДНК, выделенными из живых организмов или синтезированными искусственно. Эта технология позволяет также вносить определенные изменения в структуру естественных генов и их регуляторных элементов, комбинировать их в произвольной последовательности. Для того, чтобы проводить названные манипуляции, необходимо иметь возможность разрезать молекулы ДНК на отдельные определенные фрагменты, а затем сшивать их в нужном сочетании. Для реализации первой из названных задач используют наборы ферментов - рестриктаз.

Первые рестриктазы, пригодные для генно-инженерных целей, были выделены в 1970 году Г.Смитом (США), обнаружившим, что бактерия Haemophillus influenzae быстро расщепляет ДНК фагов. В ходе исследований, проведенных им, было показано, что нуклеазная активность (способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот ДНК и РНК), характерная для живых бактерий, сохраняется и в бесклеточном экстракте, полученном из них. Выяснилось, что нуклеазная активность обусловлена присутствием в экстракте фермента-рестриктазы, получившего название HindII. Было установлено, что выделенный и очищенный фермент способен узнавать последовательности нуклеотидов ГТПи↓ПуАЦ

ЦАПу↑ПиТГ , где Пи- любое пиримидиновое основание, а Пу – пуриновое основание, и проводить расщепление молекулы ДНК (место расщепления указано стрелками). Интересно, что рестриктаза HindII способна разрезать ДНК из различных источников, в том числе хорошо нам известной бактерии Escherichia coli (E.coli), но при этом не повреждает ДНК бактерии, из которой она была выделена.

В дальнейшем было выделено несколько сотен рестриктаз из разных бактерий, способных узнавать и расщеплять специфические последовательности нуклеотидов (сайты узнавания) в молекуле ДНК. Некоторые из этих ферментов узнают группы из четырех нуклеотидов, другие - из шести и даже более нуклеотидов. Понятно, что рестриктазы, распознающие группы из четырех нуклеотидов, вносят в молекулу ДНК, выделенную из какого-либо организма, больше разрывов, чем те, которые узнают шесть и более нуклеотидов.

Для целей генной инженерии наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми "липкими" (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось: на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные "хвосты" из нескольких нуклеотидов (Табл. 2.1). Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", то эти фрагменты соединятся между собой. Однако водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями не достаточно прочны, чтобы стабильно удерживать два объединенных фрагмента ДНК. Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. Этот фермент был впервые выделен в 1967 году из культуры E.coli, инфицированной бактериофагом Т4, при изучении энзимологии процесса репликации ДНК (то есть еще до того, как научились «разрезать» ДНК).

Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3’-концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать «липкий». Если к обоим 3’-концам двухцепочечного фрагмента присоединить несколько расположенных друг за другом адениновых нуклеотидов (поли-А), а к другому фрагменту ДНК присоединить – поли-Т, то при смешивании этих двух фрагментов они соединятся между собой, поскольку их концы комплементарны друг другу (Рис.2.1).

В современных генно-инженерных работах часто используют еще один метод произвольного сшивания фрагментов ДНК, основанный на применении так называемых линкеров – искусственных сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), состоящие из 8-10 нуклеотидных пар. Их синтезируют искусственно. При этом состав и последовательность нуклеотидов в них соответствует сайту рестрикции одной из рестриктаз, образующей липкие концы, и которая была использована при выделении фрагмента ДНК, который предполагается пришить к какому-то определенному фрагменту ДНК. Линкеры пришивают к этому последнему фрагменту ДНК с помощью ДНК-лигазы, а затем расщепляют их рестриктазой. В результате этот фрагмент приобретает липкий конец нужной нам конфигурации (Рис.2.2).

Одна какая-либо рестриктаза вносит строго определенное количество разрывов в определенных местах молекулы ДНК какого-либо анализируемого организма. В этом можно убедиться, если образовавшиеся после обработки ферментом фрагменты ДНК разделить с помощью гель-электрофореза.

Принцип этого распространенного аналитического метода, который используют для исследования белков и нуклеиновых кислот, заключается в следующем. Компоненты смеси разделяют путем пропускания ее через гель - полужидкую среду с сетчатой пространственной структурой, которую получают путем полимеризации агара, агарозы, сополимеризации акриламида и бисакриламида и др. Обычно гели готовят в виде тонких пластинок, имеющих у одного края лунки для нанесения препарата. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом. Когда через гель с нанесенным раствором пропускают электрический ток, то компоненты смеси начинают перемещаться в электрическом поле. Фрагменты ДНК или отдельные протеины, содержащиеся в анализируемой смеси, имеют разную длину, а, следовательно, и размеры. Скорость миграции компонентов смеси в геле пропорциональна их размерам: более мелкие фрагменты будут перемещаться быстрее. В результате по окончании электрофореза, когда наиболее «быстрые» компоненты смеси достигнут противоположного края гелевой пластинки, остальные равномерно распределятся по ее длине в соответствии со своими размерами. После их окрашивания специальными красителями можно наблюдать на геле спектр четко различимых полос, расположенных одна за другой, каждая из которых соответствует отдельному компоненту смеси.

Электрофоретические спектры рестрикционных фрагментов для какой-либо рестриктазы и для ДНК какого-либо организма строго специфичны. Сколько бы раз мы ни выделяли ДНК, например, вируса SV40, сколько бы раз ни обрабатывали ее рестриктазой, например Hind II, в любом случае при электрофорезе мы получим один и тот же спектр, состоящий из 11 специфических полос. На основании этого правила строят так называемые рестрикционные карты молекул ДНК, на которые наносят в установленной последовательности сайты рестрикции различных рестриктаз. Такие карты используют в молекулярной генетике для характеристики отдельных ДНК и в генной инженерии для подбора рестриктаз при выделении отдельных генов.

Исключительно важной особенностью электрофоретического разделения рестрикционных фрагментов ДНК является то, что при электрофорезе эти фрагменты не разрушаются и их можно выделить (элюировать) из геля в виде биологически активных двухцепочечных молекул. Понятно, что фрагменты ДНК, выделенные из одной какой-либо полосы, будут строго идентичны друг другу. Их далее можно анализировать на предмет определения последовательности нуклеотидов, использовать в качестве материала для построения генетических конструкций и т.д.

Технологию получения рекомбинантрых молекул ДНК по праву считают центральным звеном генетической инженерии. Поэтому можно сказать, что годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой RI и сшивания ДНК лигазой [Mertz, Davis, 1972], а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ (фаги - это вирусы бактерий) и галактозный оперон (набор генов, ответственных за расщепление молочного сахара лактозы) бактерии E.coli [Jackson, Symons, Berg, 1972].