2.4. Выделение генов

С помощью набора разных рестриктаз получают многие тысячи фрагментов ДНК, содержащих самые разнообразные гены. Каким образом в этой смеси найти и выделить один единственный фрагмент, который кодирует нужный нам ген, а также регуляторные последовательности, необходимые для его функционирования в клетке? Это один из наиболее сложных и дорогостоящих этапов генетической инженерии. Для решения проблемы идентификации генов разработаны и успешно применяются многие методы, без которых эта задача оставалась бы практически неразрешимой. Так, ученые научились определять последовательность аминокислот в белковых молекулах и последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах ДНК и РНК. Разработаны методы получения молекул ДНК, комплементарных определенным молекулам мРНК. Более того, в настоящее время вполне рутинной процедурой стал химический синтез отдельных генов! Большинство названных методов, а также радиоавтография, хемилюминесцентное маркирование, различные варианты гель-электрофореза, полимеразная цепная реакция и др. в полной мере используются для выделения и идентификации отдельных генов. В основе же самой процедуры идентификации генов лежит хорошо известный нам принцип комплементарности нуклеотидов ДНК. Рассмотрим, подробнее, каким образом все это используется на практике.

Возможны два основных подхода в выделении гена: либо его синтезируют, либо выбирают среди рестрикционных фрагментов геномной ДНК тот из них, который содержит нужный нам ген. Чаще всего эти подходы используют в различных сочетаниях с учетом конкретной ситуации. А ситуации могут быть самые разнообразные. Есть гены и протеины – продукты генов, которые изучены очень хорошо, а есть такие, про которые практически ничего не известно. Прокариотические гены выделять в общем проще, чем эукариотические, особенно в тех случаях, когда они расположены на плазмидах: поле поиска намного уже. Большое значение при выделении генов имеет степень и характер их экспрессии: проще выделять те из них, что активно транскрибируются в каких-то определенных тканях, благодаря чему в клетках этих тканей преобладает мРНК искомого гена… В любом случае выделение генов - сложный творческий процесс, требующий от исследователя глубоких знаний и владения широким арсеналом современных методов.

2.4.1. Искусственный синтез генов

Чтобы синтезировать ген искусственно, необходимо знать его последовательность нуклеотидов. Понятно, что эта последовательность должна быть такой, чтобы соответствовать последовательности аминокислот в протеине, который кодирует этот ген (продукте гена). Белки-продукты многих генов хорошо известны и изучены, в том числе на предмет последовательности аминокислот в их молекулах. Зная эту последовательность и имея под рукой таблицу генетического кода (Табл. 1.1), можно определить последовательность нуклеотидов в мРНК и в ДНК, которая должна при трансляции обеспечить синтез белковой молекулы именно с такой последовательностью аминокислот. Безусловно, искусственный ген не будет идентичен натуральному по той простой причине, что генетический код вырожденный: одной аминокислоте может соответствовать несколько сочетаний из трех нуклеотидов. Следует также иметь в виду, что гены высших организмов содержат некодирующие участки – интроны. Тем не менее, важен результат: наш искусственный ген, если его заставить работать, будет образовывать мРНК, с которой будет при трансляции синтезирован протеин, идентичный натуральному.

Замечу, что все написанное выше не из области научной фантастики, а вполне объективная реальность. Современные «автоматы-геносинтезаторы» способны присоединять один нуклеотид к синтезируемой цепочке ДНК в течение 10 минутного цикла, синтезируя фрагменты ДНК длиной более ста пар нуклеотидов. Таким методом был синтезирован, в частности, хорошо известный ген проинсулина человека, а также ряда других протеинов- продуктов современной биотехнологии.

Второй способ искусственного синтеза гена основан на использовании в качестве матрицы его мРНК. В отдельных случаях мРНК некоторых генов можно выделить непосредственно из клеток, в которых они могут быть в большом количестве. Так, например, в эритроцитах млекопитающих содержится большое количество мРНК α- и β-глобинов.

Соответствующие мРНК выделяют, тщательно очищают и используют для синтеза комплементарной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен из РНК-содержащих онкогенных вирусов. Для начала реакции полимеразной цепной реакции ферменту нужна «затравка» (праймер) в виде небольшого отрезка двухцепочечной молекулы. Эукариотические мРНК содержат, как правило, на своем 3’-конце так называемый поли-А хвост, последовательность, состоящую из остатков аденина (см. гл.1). Если к мРНК добавить синтезированные искусственно короткие олигонуклеотиды, состоящие из остатков тимина (поли-Т), они будут, в силу комплементарности, соединяться (гибридизоваться) с поли-А, образуя двойную цепочку, которая и необходима для инициации ферментативной реакции полимеризации ДНК нуклеотидов. В результате образуется гибридная двухцепочечная РНК-ДНК молекула. Далее мРНК отщепляют от этой молекулы с помощью NaOH (нить ДНК при этом не повреждается). После этого остается одноцепочечная молекула ДНК, на конце которой имеется так называемая «шпилька» (короткий отрезок двухцепочечной ДНК), которая служит «затравкой» для синтеза второй цепи ДНК под действием фермента ДНК-полимеразы I. «Шпильку» далее удаляют с помощью фермента S1-нуклеазы, которая деградирует одноцепочечные ДНК. В конце концов, получается двухцепочечная молекула ДНК, одна из нитей которой комплементарна исходной мРНК. Такую ДНК называют кДНК (комплементарная ДНК) и она, в общем, соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась мРНК. Разумеется, она не будет содержать интроны, которые могли быть у натурального гена (Рис.

Полученную кДНК с помощью технологии рекомбинантных ДНК можно соединить с соответствующими регуляторными элементами, встроить в векторную плазмиду и перенести в клетки бактерий, где они будут, реплицироваться и экспрессироваться. По их продукту можно будет окончательно убедиться, ту ли, нужную нам мРНК, мы выделили. Гены, синтезированные описанным способом, были использованы при создании генно-инженерных промышленных микроорганизмов, вырабатывающих инсулин, соматотропин (гормон роста), интерфероны, иммуноглобулины и другие протеины, необходимые для производства различных фармацевтических препаратов.