2.3. Клонирование генов

По большому счету, объединение разных молекул ДНК с помощью методов, описанных в предыдущем параграфе, само по себе бесполезно, если полученные рекомбинантные ДНК не внести в живую клетку, не заставить их там реплицироваться, и, что самое важное, заставить привнесенные гены работать: синтезировать мРНК, транслировать ее в рибосомах с образованием протеина – продукта трансгена.

Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде E.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973]. Это означало, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, то есть клонировать гены, нарабатывать достаточные объемы генетического материала для последующего изучения и возможных манипуляций с ними.

Выбор плазмиды американскими учеными в качестве вектора для клонирования оказался весьма удачным. Именно плазмидные векторы в настоящее время используют в генетической инженерии чаще всего. То же относится к бактерии E.сoli, которую чаще всего используют в качестве «места» клонирования. Попытаемся разобраться, что лежит в основе их успеха.

Оказывается, для того чтобы рекомбинантная ДНК имела возможность реплицироваться в живой клетке, она должна содержать ту часть естественной молекулы ДНК, которая «ответственна» за начало, инициацию этого процесса. Вероятность того, что она окажется в случайных рестрикционных фрагментах ДНК ничтожна. В то же время сайт начала репликации имеется в любой бактериальной плазмиде (его обозначают как ori). Поэтому, если в плазмиду встроить нужный нам фрагмент ДНК, она обеспечит репликацию как своей собственной ДНК, так и встроенного фрагмента ДНК.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Они присутствуют в клетках практически всех бактерий. Размеры плазмид от менее 1 до более 500 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Они могут быть представлены в клетке одной, несколькими, или многими (10-100) копиями. На их долю приходится до 5% суммарной клеточной ДНК. Малокопийные плазмиды реплицируются с той же скоростью, что и бактериальная хромосома, многокопийные плазмиды способны реплицироваться независимо.

Функции плазмид весьма разнообразны. Есть плазмиды, так называемые F-факторы (F-плазмиды), которые «отвечают» за прохождение полового процесса у бактерий (конъюгацию), при котором осуществляется перенос плазмид из одной бактериальной клетки в другую, а также части генетической информации, находящейся на бактериальной хромосоме. Имеются плазмиды, которые определяют устойчивость бактерий к антибиотикам (R-плазмиды), или их способность утилизировать, перерабатывать необычные вещества, например, нефтепродукты, пестициды и другие загрязнители окружающей среды (плазмиды деградации). Расположение таких генов именно на плазмидах, а не на хромосоме неслучайно. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке возможность синтеза большого количества ферментов, способных нейтрализовать антибиотики или расщеплять пестициды.

Некоторые плазмиды, называемые эписомами, могут обратимо включаться в бактериальную хромосому (к ним относятся упомянутые выше F-факторы). Если две плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке, то их относят к одной группе несовместимости. Плазмиды из разных групп несовместимости могут находиться в одной клетке независимо от числа копий. Отмечены случаи, когда у бактерий обнаруживали до 8-10 разных групп плазмид, выполняющих свои функции, и представленных характерным для каждой группы числом копий.

Плазмиды могут передаваться от одной бактериальной клетки к другой, в том числе и неродственной. Чтобы интенсифицировать процесс внедрения плазмид в бактериальные клетки в экспериментах используют специальные приемы. Например, подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлористым кальцием (CaCl₂).

Каждая плазмида обязательно содержит сайт инициации репликации (ori). Однако у одних он строго специфичен, то есть плазмиды с таким сайтом способны реплицироваться только в клетках одного вида бактерий. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они способны реплицироваться в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и широким спектром хозяев. Существование последней группы плазмид имеет, можно сказать, зловещее значение, поскольку лежит в основе быстрой передачи генов устойчивости к антибиотикам к ранее чувствительным к ним болезнетворным микроорганизмам.

В качестве векторов клонирования используют специально отобранные и генетически модифицированные плазмиды. Основные требования к вектору следующие: 1) небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в E.сoli значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 т.п.н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; 3) наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

Процедура клонирования фрагментов ДНК осуществляется следующим образом. Первый этап включает разрезание кольцевой молекулы ДНК плазмиды, которую используют в качестве вектора клонирования. Плазмида, как правило содержит два маркерных гена, например, гены устойчивости к двум разным антибиотикам. Обычно место расщепления плазмидной ДНК находится в пределах структурной последовательности одного из ее маркерных генов. Такой же самой рестриктазой (желательно, образующей липкие концы) разрезают ДНК, фрагменты которой предполагается клонировать (донорной ДНК), и смешивают с «разрезанной» плазмидной ДНК. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они соединяются с образованием гибридных молекул. Процесс сшивки «закрепляют» путем добавления в раствор фермента ДНК-лигазы фага Т4. В результате образуется смесь разных комбинаций плазмидной и донорной ДНК, а также такие нежелательные продукты, как слившиеся фрагменты только донорной ДНК или восстановленные кольцевые молекулы плазмидной ДНК. Их количество уменьшают с помощью специальных химических методов (Рис 2.4).

Рекомбинантные плазмиды, содержащие встроенные фрагменты донорной ДНК далее вводят в клетку-хозяина, обычно это - E.сoli. Для этого бактерии смешивают с раствором плазмид, в который добавляют хлористый кальций, подвергают клетки нагреванию. Тем не менее, эффективность трансформации (внедрения чужеродной ДНК в клетку) остается невысокой: порядка одной клетки на тысячу. Что получается в результате? Большинство бактериальных клеток остаются интактными. Небольшое количество клеток содержит различные рекомбинантные плазмиды. Могут также быть клетки, содержащие те самые нежелательные продукты из предыдущего этапа: интактные векторные плазмиды, или фрагменты донорной ДНК. Судьба последних очевидна. Бактрии быстро избавляются от чужеродной ДНК. Чужеродная ДНК, не имеющая сайта инициации репликации, не может реплицироваться в бактериальной клетке и разрушается под действием эндонуклеаз.

Таким образом, задача сводится к тому, чтобы разделить первые три типа бактериальных клеток. Для этого их последовательно высевают на питательные среды, содержащие антибиотики, являющиеся селективными агентами в нашем эксперименте. Нетрансформированные клетки чувствительны к обоим антибиотикам, клетки с интактными плазмидами, напротив, устойчивы к обоим антибиотикам, а клетки с рекомбинантными плазмидами устойчивы только к тому антибиотику, ген устойчивости к которому не поврежден в результате рестрикции и вставки фрагмента донорной ДНК. Поскольку рекомбинантная плазмида содержит все необходимое для инициации репликации, то она может реплицироваться в бактериальных клетках, то есть осуществлять клонирование своей, а также встроенной в нее донорной ДНК.

Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы: фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), а также так называемые искусственные хромосомы на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК длиной 100-300 т.п.н.), на основе F-плазмиды E.сoli (BAC – бактериальная искусственная хромосома, емкость 150-300 т.п.н.), дрожжей (YAC-дрожжевая искусственная хромосома, в ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E.сoli используют также Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisiae и др.