Глава 9

Основы генетической инженерии растений.

Технология рекомбинантных ДНК. Этапы создания генно-инженерных организмов (ГИО). Методы выделения, идентификации и клонирования генов. Строение трансгенных конструкций. Целевые гены. Трансгены и цисгены. Селективные и репортерные гены. Регуляторные элементы. Смысловые и антисмысловые конструкции. Методы переноса генов в растения. Агробактериальная трансформация. Метод биолистики. Трансформация протопластов. Отбор и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений. Детекция ГМ-компонентов в продуктах питания и кормах. Проблема экспрессии трансгенов. Получение трансгенных растений без селективных генов.

Ниже материал к этой главе из книги «Биотехнология. Биобезопасность. Биоэтика», который будет использован в качестве основы для данной главы.

Глава 2. Как получают генно-инженерные организмы

2.1. Что такое генетическая инженерия?

Существует много определений генетической инженерии. На взгляд авторов, суть этой новой технологии можно выразить следующим образом. Генетическая инженерия – это технология получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства.

Как видно из этого определения, процесс создания ГИО можно разделить на несколько этапов. Первый этап включает выделение и идентификацию отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам, а также соответствующих регуляторные элементов (без них никакой ген функционировать не будет!). Иногда гены, или их части синтезируют искусственно.

Затем эти гены и регуляторные элементы соединяют между собой в определенном порядке с помощью чисто химических методов (технология рекомбинантных ДНК, или генная инженерия). То есть, все названные манипуляции проводят вне организма, in vitro (в пробирке). В результате получается генетическая конструкция, которая содержит один или несколько генов (точнее, фрагментов ДНК, которые кодируют последовательность аминокислот протеинов – продуктов генов), а также все необходимые регуляторные элементы, обеспечивающие активность этих генов (трансгенов) после их переноса в организмы. Такие генетические конструкции далее соединяют с ДНК так называемого вектора для клонирования. В качестве вектора чаще всего используют плазмиды - небольшие кольцевые молекулы ДНК, имеющиеся у большинства бактерий. Создание конструкции «клонирующий вектор-встроенная ДНК» необходимо для эффективного переноса и активности трансгенов (репликации и трансляции) в живых организмах.

Следующий этап – перенос трансгенов в отдельные живые клетки (процесс трансформации, или, как принято его называть в последнее время, - «генетической модификации»), где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам, образовавшимся при делении трансформированных клеток. В случае, если все описанные процедуры прошли нормально, из одной трансформированной клетки при культивировании образуется множество клеток, которые содержат привнесенную искусственную генетическую конструкцию, и при этом образуются протеины-продукты трансгенов. Биосинтез новых для организма протеинов является основой для проявления у него нового селекционного признака, например, толерантности к гербицидам, антибиотикам, устойчивости к насекомым-вредителям и т.д.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации заканчивается, как правило, внедрением в них рекомбинантной плазмиды и последующим отбором трансформированных клеток. Лишь в отдельных случаях для более высокой стабильности трансформантов добиваются включения трансгенов в бактериальную хромосому. В случае же высших многоклеточных организмов встраивание трансгенов в генетический материал клетки (ДНК хромосом или клеточных органелл – хлоропластов, митохондрий) является обязательным. Более того, необходимо из одной или нескольких трансформированных клеток восстановить целый организм. А это весьма непростая задача, которая была решена (правда, не для всех видов организмов в полной мере) сравнительно недавно. В частности, первые растения, регенерированные из отдельных клеток, были получены в начале 60-х годов прошлого века, что стало возможным благодаря разработке эффективных методов культивирования изолированных растительных клеток на специальных питательных средах. Добавка в питательные среды определенных регуляторов роста (фитогормонов) позволяет управлять процессами деления клеток в культуре in vitro, а также, что самое главное, индуцировать у них морфогенез: то есть «заставлять» их образовывать отдельные органы (стебли, корни) или даже целые зародыши (процесс эмбриогенеза), из которых в дальнейшем можно получить целое растение.

Рассмотрим подробнее, каким образом осуществляют перечисленные манипуляции.