Фракционирование клеток

В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно по­лучить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изу­чать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоя­щее время в виде чистых фракций получают практически любые кле­точные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и др. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядер­ных пор.

Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структyp является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15—30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из ми­тохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, перок­сисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мемб­ран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуо­лей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности саха­розы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначи­тельно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью элек­тронного микроскопа.

Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезиро­вать белок по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответству­ющих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.

В последнее время применяются бесклеточные системы для воссо­здания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищен­ные от гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из вве­денной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мемб­ранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные си­стемы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро, и наоборот. В цито-плазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огром­ный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.

Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инже­нерии. Найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка — гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис. 14). Если гете­рокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объеди-

После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конст­руировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию, клетку можно разделить на две части: ядро с узким ободком цитоплазмы — кариопласт и на оставшуюся часть цито­плазмы — цитопласт. Затем, используя разные кариопласты и цитопла-сты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.

Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. На­пример, при получении моноклональных антител используются кле­точные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные пер­вичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки, которые и нтенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных кле­ток, и одновременно выделяют большое количество антител за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволя­ет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.

Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для то­го, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволя­ющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и разме­ра клетки и кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.