96 Капіляра може працювати одночасно

Більшість автоматизованих секвенаторів тепер використовують електрофорез через дуже тонкі капіляри для розділення фрагментів ДНК, продуктів реакції секвенування. Всі чотири флуоресцентно мічені реакції проходять через один капіляр. Машини, такі як ABI 3700, зображені на цьому слайді, мають 96 капілярів, які можуть працювати одночасно.

Послідовність читання радіоактивно мічений реакції

Радіоактивно мічені реакції

-гель сушать

-розміщюють на рентгенівській плівці

-послідовність читають знизу вгору

-кожна смуга являє собою різні основи

На заключному етапі секвенування потрібно прочитати послідовності. Радіоактивно мічені послідовності реакцій проходять через гель, гель сушать, а потім шматок рентгенівської плівки знаходиться на ньому. Після фільму (film is developed), положення кожної групи стає видимим. Послідовність читають з нижньої частини гелю на верх, по кожній з чотирьох смуг визначаючи позицію кожної основи: A, T, C і G.

Послідовність читання флуоресцентно мічених реакцій

Флуоресцентно мічені реакції скануються лазером, що в певний момент передається

Колір підбирається детектором

Вихідні дані направляється безпосередньо до комп'ютера

Для флуоресцентно мічених реакцій, які розділяються або гелем-електрофорезом або через капіляр, фрагменти виявляються лазерем, коли вони проходять через певну точку. Кожен з чотирьох кольорів підібраний за допомогою детектора, а вихідні дані надходять безпосередньо на комп'ютер. Зчитування дається як з точки зору кількості основ і з точки зору інтенсивності кожного кольору, так що неоднозначні свідчення легко ідентифікуються.

Оптичне картування

Одно-молекулярні технології

Окремі молекули ДНК прикріплені до скла

Коли ДНК розрізають, мікроскоп записує довжину фрагментів

Наявність потенціалу для швидкої генерації карт рестрикції

На сьогоднішній день постійно розробляються технології спрямовані на підвищення ефективності та швидкості картування та секвенування. Оптичне картування було розроблено для прискорення процесу фізичного картування. У цьому методі, окремі молекули ДНК виділяють і прикріпляють до стекла. Рестрикційні ферменти, які знаходяться в розчині на слайді, потім активують. Коли ДНК розрізається ферментами рестрикції, камери, що

підключена до мікроскопу записує довжину отриманих фрагментів. Цей метод є успішним у картуванні різних геномів і має потенціал, щоб швидко генерувати карти, які засновані на рестрикційно-ферментному розщепленні.

Піросеквенування 1

Виробництво пірофосфатів в реакції секвенування

Кожен раз, коли полімераза додає нуклеотид (dNTP) на зростаючі ланцюги, пірофосфат (РР) вивільняється

Кількість пірофосфатів, що вивільнились дорівнює числу доданих нуклеотидів

Піросеквенування використовує включення нуклеотидів за допомогою полімерази для визначення послідовності ДНК. Однак, на відміну від послідовності Сенгера, де використовується зупинка ланцюга, піросеквенування виявляє включення кожного нуклеотида через випуск пірофосфату (PPI). Кількість звільненого PPi, пропорційно кількості доданих нуклеотидів. Таким чином, якщо нуклеотид додається, то така є кількість PPi буде відпущена. Якщо два нуклеотида буде додано, один за одним, то в два рази більше PPi буде відпущено.