Секвенування

Всі великі проекти секвенування використовують метод Сенгера

На підставі дії ДНК-полімерази

• потрібна ДНК-матриця і праймери

• полімераза і нуклеотиди

Полімераза додає нуклеотиди у відповідності до матриці

Включено невелику кількість нуклеотидних аналогів

--зупинка синтезу

Нобелівські премії були присуджені за два різних метода визначення послідовності ДНК. Метод, розроблений Максом і Гілбертом використовує хімічні засоби розривання ланцюгів ДНК в певних основах. Він потужним і точним, але цей метод вимагає використання токсичних хімічних речовин. Метод, розроблений Фредом Сенгером використовує фермент, відповідальний за реплікацію ДНК, ДНК-полімеразу. Завдяки своїй простоті, всі великі проекти секвенування сьогодні використовують метод Сенгера. Для подовженого ДНК, ДНК-полімераза потребує ДНК-матриці і праймерів. Вона також потребує вільних нуклеотидів. При відповідній температурі і концентрації солі, ДНК-полімераза буде додати відповідні нуклеотидні навпроти матричної основи. Нуклеотиди додані у відповідності з додатковими правилами розробленими Уотсон і Крик: А протилежний T, C протилежної G, і навпаки для обох пар. Для проведення реакції секвенування, невелика кількість нуклеотидних аналогів додається. Коли включений в зростаючий ланцюг ДНК, нуклеотидна аналогія - синтез зупиняється, тому що ДНК-полімераза не може додати ще одну основу в аналогічну.

Реакція секвенування

Метод ланцюгової термінації ( зупинки)

- використовуються дидезоксі нуклеотиди

При додаванні потрібної кількості – ланцюг зупиняється

- кожен раз коли основа прикріпляеться до матриці

Потрібна реакція для кожної основи: A, T, C і G.

На завершення метод зупинки ланцюга Сенгер, нуклеотидні аналоги називаються дидеоксінуклеотидами. При правильній кількості додають у розчин, ланцюг буде зупинено при наявності комплементарних нуклеотидів в матриці. Наприклад, якщо потрібну кількість дидезоксі А додається, то ланцюг буде зупинено в кожному випадку Т в матриці. Щоб визначити повну послідовність потрібні окремі реакції для кожної з чотирьох основ A, T, C і G.

Детекція послідовності

Детекція продуктів реакції секвенування

Включення мічених нуклеотидів

Раніше використовувалися радіактивні мітки

Тепер використовуються флуоресцентні мітки

Використовуються різні флуоресцентні мітки для кожного нуклеотида

Можуть працювати всі чотири основи в тій же смузі

Коли реакція секвенування завершується, дослідник повинен ідентифікувати новосинтезовані ланцюги. Це може бути зроблено за допомогою радіоактивно мічених нуклеотидів в реакції. В якості альтернативи, автоматизовані секвенатори на сьогоднішній сьогоднішній всі використовують флуоресцентні мітки. Кожна з чотирьох реакцій секвенування (для A, T, C і G, відповідно) використовує інший колір флуоресцентної мітки. Після того, як реакція завершена, чотири флуоресцентно мічені реакції можуть бути об'єднані і працюють в одній смузі гелю або капілярній трубці.

Поділ послідовності

Зупинений ланцюг потребує розділення ( за мол. мас.)

Потрібна одна пара основ

-Див різницю між ланцюгом X і X +1 пар основ

Гель-електрофорез

-дуже тонкий гель

-висока напруга

-використання радіоактивних або флуоресцентних міток

Щоб визначити розташування кожної з основ в послідовності потрібно зупинити синтез ланцюгів і розділити їх, що побачити різницю розходження кожної з основ. Це означає, наприклад, що ланцюг довжина 35 основ повинні буде відрізнятися від ланцюга 34 або 36 основ. Ця задача зазвичай виконується за допомогою електрофорезу за допомогою гелю або капіляр. Використовують дуже тонкий гель, з високою напругою. Або радіоактивно мічені або флуоресцентно мічені продукти реакції можуть бути розділені на гелі.

Капілярний електрофорез

Нові автоматизовані секвенатори використовують дуже тонкі капіляри

Всі чотири флуоресцентні реакції проводяться в одному капілярі